miR-34a通過HDAC1調控子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的機制研究

何武奇，羅婷娟，王沂峰

子宮內膜癌(endometrial cancer, EC)是最常見的婦科癌癥，也是女性第4大常見癌癥[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是由20～24個核苷酸組成的非編碼RNA序列，已有研究顯示，有些miRNA(如miR-15a-5p、miR-137、miR-250等)與EC的發生和發展有相關性，并且miRNA還可通過靶向調節下游基因的表達參與EC的發展[2-4]。國內有研究顯示，miR-34a可能與EC的臨床特征有密切關系[5]。國外也有研究顯示，miR-34a具有調節EC轉移的作用[6]。但是關于miR-34a對EC細胞的影響及其作用機制尚不明確。組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase-1, HDAC1)是一種重要的表觀遺傳因子，具有調節腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用[7]。本次研究發現miR-34a對EC具有抑癌作用，并能夠通過靶向HDAC1調節EC細胞的增殖和凋亡。現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗試劑與儀器 人EC細胞系HEC-1A細胞購自ATCC細胞庫(美國)。DMEM培養基、胎牛血清購自Invitrogen公司(美國)。miR-34a類似物(mimic)、HDAC1 pcDNA以及相應的陰性對照質粒由Thermo Fisher公司(美國)設計和合成。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(加拿大)。熒光酶素報告試劑盒(Promega；Madison，美國)。CCK-8試劑盒購自武漢華美生物科技公司(中國)。酶標儀(ELX 800；Bio-Teck，美國)。凋亡試劑盒購自武漢華美生物科技公司(中國)。流式細胞儀(BD FACScanto Ⅱ；BD Biosciences，美國)。HDAC1、Wnt1、β-catenin抗體以及二抗購自Abcam公司(美國)。PVDF膜(Bio-Rad，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設計和合成。逆轉錄試劑盒和SYBR Prellix Ex Taq TM實時PCR試劑盒購自TaKaRa公司(日本)。

1.2生物信息學預測和熒光素酶報告 通過TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-34a的靶基因和潛在結合位點。使用雙熒光素酶報告驗證在HEC-1A細胞中是否靶向HDAC1。首先分別將HDAC1-wt(野生型)或HDAC1-mut(突變型)以及miR-34a mimic或陰性對照質粒通過質粒轉染技術轉染至HEC-1A細胞中，最后使用熒光酶素報告試劑盒評估熒光素酶活性。

1.3細胞分組和轉染 將HEC-1A細胞分為對照組、mimic組、mimic+HDAC1組和HDAC1組。其中mimic組、mimic+HDAC1組和HDAC1組按照分組分別通過質粒轉染技術轉染miR-34a mimic或(和)HDAC1 pcDNA以上調miR-34a或(和)HDAC1的水平；對照組轉染等量的陰性對照質粒，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4qPCR檢測miR-34a和HDAC1 mRNA表達水平 細胞在液氮的保護下裂解并收集總RNA，將RNA通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。通過cDNA進行qPCR檢測，95℃下2 min，95℃下15 s，60℃下25 s和72℃下60 s，共進行40個循環。以U6作為miR-34a的內參，以GAPDH作為HDAC1的內參，使用2-ΔΔCT法計算miR-34a和HDAC1 mRNA的相對表達量。

1.5CCK-8法檢測細胞生長情況 將轉染后的各組細胞調節至2×104/ml的密度，分別接種于96孔板中，每孔100 μl，培養48 h后加入10 μl的CCK-8試劑，37℃條件下培養2 h。然后在酶標儀上測量450 nm處的光密度(OD)以觀察細胞生長情況，計算細胞活力。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡情況 將各組細胞培養48 h后加入凋亡試劑進行標記，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，然后通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

1.7Western blot檢測HDAC1、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平 將各組細胞清洗后裂解、離心收集總蛋白并檢測蛋白濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，100 V下電泳120 min。電泳后轉膜至PVDF膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。分別加入相應的一抗室溫震蕩2 h，然后4℃孵育過夜，加入二抗。檢測蛋白條帶的灰度值并計算目標蛋白質的相對表達量。

2 結果

2.1miR-34a直接靶向HDAC1 首先通過TargetScan預測了miR-34a靶向HDAC1的結合位點。見圖1。然后通過雙熒光素酶實驗驗證了同時轉染miR-34a mimic和HDAC1-wt細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見圖2。說明在HEC-1A細胞中miR-34a直接靶向HDAC1。

圖1 TargetScan預測miR-34a與HDAC1的潛在結合位點

HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1

圖2 miR-34a靶向HDAC1的熒光素酶報告實驗結果

HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1；與HDAC1-mut比較，aP<0.05

2.2miR-34a以及HDAC1 mRNA和蛋白的表達水平比較 與對照組比較，mimic組和mimic+HDAC1組的miR-34a表達水平顯著升高，HDAC1組的HDAC1 mRNA和蛋白表達水平也顯著升高(P<0.05)，提示轉染實驗成功。此外，mimic組的HDAC1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。mimic+HDAC1組的HDAC1 mRNA和蛋白表達水平顯著高于mimic組(P<0.05)。說明miR-34a可以靶向抑制HDAC1的表達，并且過表達HDAC1可逆轉miR-34a對HDAC1的抑制作用。見表1和圖3。

表1 4組HEC-1A細胞miR-34a以及HDAC1 mRNA和蛋白的相對表達水平比較

注：對照組轉染陰性對照質粒，mimic組轉染miR-34a mimic，mimic+HDAC1組轉染miR-34a mimic和HDAC1 pcDNA，HDAC1組轉染HDAC1 pcDNA；HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1；與對照組比較，aP<0.05；與mimic組比較，cP<0.05

2.3細胞活力和凋亡率比較 與對照組比較，mimic組的細胞活力顯著降低，而凋亡率顯著升高(P<0.05)。此外，HDAC1組的細胞活力顯著高于對照組，而凋亡率顯著低于對照組(P<0.05)。并且mimic+HDAC1組的細胞活力顯著高于mimic組，而凋亡率顯著低于mimic組(P<0.05)。見表2。

圖3 4組HEC-1A細胞中HDAC1蛋白的表達水平

對照組轉染陰性對照質粒，mimic組轉染miR-34a mimic，mimic+HDAC1組轉染miR-34a mimic和HDAC1 pcDNA，HDAC1組轉染HDAC1 pcDNA；HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1

表2 4組HEC-1A細胞的細胞活力和凋亡率比較

注：對照組轉染陰性對照質粒，mimic組轉染miR-34a mimic，mimic+HDAC1組轉染miR-34a mimic和HDAC1 pcDNA，HDAC1組轉染HDAC1 pcDNA；HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1；與對照組比較，aP<0.05；與mimic組比較，cP<0.05

2.4Wnt1和β-catenin蛋白表達水平比較 與對照組比較，mimic組的Wnt1和β-catenin蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。HDAC1組的Wnt1和β-catenin蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。并且mimic+HDAC1組的Wnt1和β-catenin蛋白表達水平顯著高于mimic組(P<0.05)。見表3。

表3 4組HEC-1A細胞的Wnt1和β-catenin蛋白表達水平比較

注：對照組轉染陰性對照質粒，mimic組轉染miR-34a mimic，mimic+HDAC1組轉染miR-34a mimic和HDAC1 pcDNA，HDAC1組轉染HDAC1 pcDNA；HDAC1為組蛋白去乙酰化酶1；與對照組比較，aP<0.05；與mimic組比較，cP<0.05

3 討論

盡管超過70%的EC患者可以在早期得到診斷，但仍有多達28%的患者出現局部或遠處轉移。不幸的是EC的預后通常很差，5年生存率小于40%。目前，我國EC患者的發病率呈上升趨勢，雖然大多數EC能夠早期診斷，并且通過外科手術進行管理獲得良好臨床結果，但由于缺乏對晚期、復發或轉移EC的有效治療手段，仍有許多病例預后不良[8]。因此，開發新的EC治療策略至關重要，而明確EC發生的分子機制則有助于開發新的EC治療靶點。

miR-34a是近年來新發現的一種與腫瘤發生和發展密切相關的miRNA，過往有研究顯示，miR-34a可以作為診斷和治療卵巢癌的生物標志物[9]。Tian等[10]的研究發現，肝細胞癌患者血清中miR-34a顯著降低，并且與肝細胞癌的臨床表型和預后有關，可作為診斷肝細胞癌的標志因子。國內最新研究顯示，miR-34a在EC患者中顯著下調，并且低水平的miR-34a預示著EC的惡性表型，提示miR-34a在EC發生和發展過程中的重要作用。本次研究結果顯示，過表達miR-34a會顯著抑制EC細胞的生長并促進EC細胞的凋亡，這與國外的相關研究結果一致，該研究顯示miR-34a可以抑制EC的增殖和侵襲[11]。這提示miR-34a可以抑制EC細胞的增殖并促進其凋亡，發揮著顯著的抑癌作用。

為進一步分析miR-34a調節EC細胞增殖和凋亡的機制，本研究驗證了在HEC-1A細胞中miR-34a能夠靶向調節HDAC1的表達。HDAC1是一種重要的表觀遺傳因子，可拮抗組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態，與癌癥的發展和進展密切相關。HDAC1已被證實在許多癌癥中過表達，包括乳腺癌、肺癌、結腸癌等，HDAC1可作為預測病情和預后的標志因子[12-14]。Stojanovic等[15]研究發現，HDAC1可通過調節p53的表達促進胰腺癌的進展。國內也有研究顯示，HDAC1具有調節細胞凋亡的作用[16]。還有研究發現，干擾HDAC1后還會增強癌細胞的化療敏感性[17]。本文進一步的研究結果顯示，過表達HDAC1可顯著促進EC細胞的增殖，并抑制其凋亡，還能逆轉miR-34a抑制EC細胞增殖和促進凋亡的作用。此外，也有研究顯示miR-761可通過靶向HDAC1的水平抑制結直腸癌的增殖和侵襲[18]。這提示miR-34a可通過靶向抑制HDAC1的水平，從而抑制EC細胞增殖并促進其凋亡。有相關研究已經證實，Wnt/β-catenin通路在EC中的作用[2]。本次研究結果還顯示，miR-34a能夠抑制Wnt1和β-catenin蛋白表達，而HDAC1促進Wnt1和β-catenin蛋白表達，并部分逆轉miR-34a對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。Masoumi等[19]的研究顯示，HDAC1具有調節Wnt通路的作用。國內也有研究顯示，HDAC1可通過調控Wnt/β-catenin調節乳腺癌細胞的凋亡[20]。

綜上所述，miR-34a可通過靶向調節HDAC1的水平調控EC細胞的增殖和凋亡，這種調節作用可能通過影響Wnt/β-catenin通路實現。但是關于miR-34a以及HDAC1在EC中的具體作用機制還需要進一步研究。