咪唑苯脲注射液特殊安全性試驗研究

劉欣彤，王玉鳳，陳孝杰，劉義明，徐 飛，王宏磊，張志博，張向陽，李 存，李秀波*

(1.中國農業科學院飼料研究所,國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081；2.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

咪唑苯脲注射液(imidocarb，IM)又稱雙脒苯脲或咪多卡，是一種動物專用二苯基脲衍生物類新型抗原蟲的化學藥物[1]。該藥是由Schmidt應用鼠駱巴貝西蟲篩選均二苯脲類化合物時發現的，由Beveridge研究證實該藥的半數致死量低于其他抗巴貝西蟲藥物，已上市產品由瑞士Monbijoustrasse公司研發[2]。我國在1985年首次成功合成了咪唑苯脲的二丙酸鹽和雙鹽酸鹽形式。由于雙鹽酸鹽對局部組織具有較強刺激性，臨床上一般常用二丙酸鹽做成制劑[3]，通過肌肉或皮下注射的方式給藥[4]。在抗犬[5]、牛[6]、羊[7]、羔羊[8]、馬[9]巴貝西蟲病方面具有良好的治療和預防效果，也可用于抗牛泰勒蟲病[10]、抗牛邊蟲病[11]、抗小鼠利什曼病[12]、抗犬埃立克體病[13]、抗羊/豬附紅細胞體病[14-15]、抗梨形蟲病[16]、抗錐蟲病[17]等[18]。注射后迅速吸收并分布于全身組織，1 h后即可達到血藥峰濃度，在腎臟中濃縮并以原型再吸收，在肝臟中解毒。本品毒副作用較小，但靜脈注射毒性大，且內服無效[19]。作為獸用專用藥，咪唑苯脲具有用量小、藥效持久、療程短、刺激小、耐藥性低、使用方便等特點。該藥已廣泛應用于世界各地，是當今國際公認的最佳抗原蟲藥[20]。鑒于國內當前沒有咪唑苯脲注射液臨床使用有關全部特殊安全性方面的資料，且我國已批準進口該藥，根據農業部公告要求，在國內生產此產品，須進行特殊安全性試驗。因此，本研究通過豚鼠、新西蘭大白兔的皮膚致敏、皮膚刺激、肌肉刺激、紅細胞溶血試驗，全面考察咪唑苯脲注射液的特殊安全性，為其臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 咪唑苯脲注射液，1211.5 mg/mL，由齊魯動物保健品有限公司提供，批號：1503003。陽性對照藥物：1-氯-2,4-二硝基苯(含量99%)，購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 試驗動物 新西蘭大白兔(體重2.5～3 kg) 16只，雌雄各半，單籠、常規飼料喂養，自由飲水，由北京市海淀興隆實驗動物養殖廠提供，動物質量合格證編號為：SLB112018122420091788和SLB112018122420091780；豚鼠系Hartley種白化豚鼠26只(一級，體重260～320 g)，雌雄各半，常規飼料喂養，自由飲水，由北京市海淀興旺動物養殖場提供，動物生產許可證編號：SCXK(京)2016-0003。

1.3 試驗方法及判定原則

1.3.1 皮膚刺激試驗 采用新西蘭大白兔進行，分組及劑量見表1。取咪唑苯脲注射劑，直接涂布于左側已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm) 和一層無刺激塑料膜覆蓋，再用無刺激膠布固定，家兔的右側去毛皮膚涂布賦形劑(生理鹽水) 作對照。貼敷4 h后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。每天一次，連續7 d，每次給藥時間相同。每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前觀察去毛部位皮膚是否有紅斑、水腫及其他異常表現，并在末次給藥后1、24、48、72 h肉眼觀察去毛部位皮膚局部反應，按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[21](以下簡稱《原則》)進行刺激反應評分。按表2判定受試動物評分積分的平均值進行綜合評價，最高積分均值<0.50，無刺激性；0.50～2.99，輕度刺激性；3.00～5.99，中度刺激性；6.00～8.0，強刺激性。

表1 皮膚刺激試驗分組、劑量

表2 皮膚刺激反應評分標準

1.3.2 皮膚致敏試驗 采用白化豚鼠進行，分組及劑量見表3，以豚鼠背部左側皮膚進行染毒。先進行誘導接觸，分別在試驗0、7、14 d 時，在試驗組豚鼠左側備皮處涂敷咪唑苯脲注射液，在陽性對照組動物相同部位涂敷2，4-二硝基氯苯。末次誘導后14 d進行激發接觸，實驗組和陰性對照組涂敷咪唑苯脲注射液，陽性對照組動物涂敷2，4-二硝基氯苯。激發接觸實驗染毒后24、48、72 h，根據表4和表5評判是否出現皮膚致敏反應并判定致敏強度。

表3 皮膚致敏試驗分組、劑量

表4 皮膚過敏反應程度的評分標準

表5 皮膚致敏性評價標準

1.3.3 肌肉刺激試驗 采用新西蘭大白兔進行，分組及劑量見表6。試驗前24 h剪去兩側股四頭肌部位的兔毛，碘酊和乙醇消毒后分別在右側股四頭肌注入受試藥物(對照組注入0.9%氯化鈉溶液)，左側股四頭肌注入同樣體積的滅菌0.9%氯化鈉溶液作為右側的對照。給予受試物后4、12、24、48 h觀察皮膚表面的反應及變化情況。觀察48 h后將家兔處死，剖開股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收情況，檢查注射局部是否產生刺激性反應；并將高、中、低劑量組和對照組各2只(雌雄各1只) 注射部位肌肉標本用10%中性福爾馬林固定液浸泡固定，做組織切片進行病理學檢驗。根據《原則》進行刺激反應評分。根據表7計算肌肉刺激性總反應級，計算平均值，按表8判定刺激等級。若各股四頭肌反應級的最高與最低之差大于2，應另取動物重新試驗。

表6 肌肉刺激試驗分組和劑量

表7 肌肉刺激反應分級標準

表8 平均分值和等級

1.3.4 溶血試驗 試驗動物為新西蘭大白兔2只，采用體外試管法，即肉眼觀察法進行，分組及劑量見表9。采心臟血50 mL，制成脫纖血液，處理后置37 ± 0.5 ℃的恒溫箱中進行溫育。15 min、1 h、2 h、3 h各觀察1次，若試驗中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發生；如紅細胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細胞凝聚發生。如有紅細胞凝聚的現象，進一步判定是真凝聚還是假凝聚。

表9 紅細胞溶血試驗分組、劑量

2 結果與分析

2.1 皮膚刺激試驗 6只受試新西蘭大白兔連續給藥7 d期間，在其去毛部位均未觀察到皮膚紅斑、水腫及其他異常表現，且在停藥后觀察期限內的各個時間點均未出現紅斑和水腫等刺激反應，見圖1；根據《原則》判定受試物咪唑苯脲注射液各個時間點的刺激反應積分均值為0，與陰性對照組比較無顯著差異，詳見表10，表明受試物咪唑苯脲注射液對新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

圖1 新西蘭大白兔皮膚刺激結果

表10 皮膚刺激分值

2.2 皮膚致敏試驗 受試藥物組和陰性對照組豚鼠的皮膚在激發給藥24、48、72 h 后，皮膚均未見紅斑和水腫現象(圖2)；根據《原則》判定受試藥物組和陰性對照過敏反應率為0，而陽性對照組豚鼠均出現嚴重或中度紅斑和水腫，過敏反應發生率為100%(表11)表明受試藥物咪唑苯脲注射液對豚鼠皮膚進行誘導后不出現過敏反應，試驗結果為陰性。

圖2 豚鼠給藥后 72 h 皮膚致敏結果

表11 皮膚致敏率

2.3 肌肉刺激試驗 給予受試物后4、12、24、48 h均未觀察到注射部位充血、瘙癢、起包。給予受試物后48 h 處死各劑量組和對照組各2只(雌雄各1只) 家兔，病理顯示其組織注射部位血管未見出血、血栓、血管擴張充血、間質炎細胞浸潤及血管壁周圍組織壞死等異常改變，詳見圖3。判定各個時間點的刺激反應分值均為0，與陰性對照組比較無顯著差異，詳見表12，由此表明受試物咪唑苯脲注射液對新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

表12 刺激性反應分值

圖3 新西蘭大白兔給藥后48 h 皮膚致敏及病理結果

2.4 溶血試驗 圖4結果顯示，1～6號試管在3 h內紅細胞全部下沉，上清液體均為澄明，溶液中未見有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；7號試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留。結果可判定受試藥物及陰性對照未發生溶血和凝聚，陽性對照組發生溶血，表明咪唑苯脲注射液對兔紅細胞無溶血和凝聚作用，可以注射使用。

圖4 新西蘭大白兔紅細胞溶血性結果

3 討論與結論

藥物特殊安全性試驗是注射劑臨床前安全性評價的重要組成部分，主要由體外溶血性試驗、過敏性試驗、局部刺激性試驗等組成。任何一項試驗結果出現陽性，則表明該藥安全性評價不符合標準，不宜通過注射途徑給藥[21]。藥物刺激性是指藥物制劑經非口服途徑給藥，對用藥局部產生刺激性。通過藥物在給藥部位使用后是否引起局部或全身毒性，以揭示臨床應用時可能出現的毒性反應、安全范圍等指標，并為臨床提供參考[22]。

咪唑苯脲注射液涂敷部位的皮膚刺激試驗，給藥劑量為0.5 mL。試驗中同時進行了生理鹽水的陰性對照試驗。結果表明，受試兔在給藥后的1 h內和每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前去毛部位皮膚均未出現異常表現；在試驗的第7天及停藥后3天內受試兔外觀及病理觀察均正常。由此可見，咪唑苯脲注射液經皮膚涂敷連續給藥7天及停藥后對受試兔是安全的。

咪唑苯脲注射液注射部位的肌肉刺激試驗，給藥劑量為0.1 mL/kg，約為臨床正常劑量(1倍劑量)。試驗中同時進行了2倍劑量組、5倍劑量組和0.9%氯化鈉溶液的對照組試驗。結果表明，每組受試兔的刺激反應分值均為0，與陰性對照組比較無顯著差異；剖檢股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收良好，注射局部未產生刺激性反應；病理組織注射部位肌肉切片的血管未見異常改變，病理學檢驗正常。由此可見，咪唑苯脲注射液以5倍劑量經肌肉注射對受試兔是安全的。

隨著上市新藥的增多，尤其是注射途徑藥物的廣泛應用，藥物致敏反應的發生率大大提高[21]。因此，臨床前致敏反應評價非常關鍵。皮膚致敏是將具有致敏作用的化學物質經一定途徑進入機體，與組織蛋白結合形成完全抗體，刺激免疫活性細胞產生致敏淋巴細胞或體液抗體；經1～2周致敏期，使體內免疫反應得到充分發展，形成一定數量的致敏淋巴細胞或特異抗體；當再次接觸(激發)時使機體對該化學物質產生感受性增高的狀態，以一定的異常形式表現出來的反應。

咪唑苯脲注射液涂抹部位的皮膚致敏試驗，給藥劑量為0.5 mL/kg。試驗中同時進行了涂抹0.2 mL 2，4-二硝基氯苯的陽性對照和末次誘導后14 d再涂敷咪唑苯脲注射液的陰性對照。結果表明，激發接觸實驗染毒后受試藥物組和陰性對照組受試豚鼠，無肉眼可見的病理變化，受試物咪唑苯脲注射液無過敏反應；陽性對照組豚鼠均出現過敏反應。由此可見，咪唑苯脲注射液以0.5 mL/kg的劑量經皮膚涂敷給藥對受試豚鼠是安全的。

藥物制劑引起體內溶血可分為免疫性溶血和非免疫性溶血兩類，都通過藥物引發溶血反應。因此，凡是注射液和可能引起溶血反應的其他藥物制劑均應進行溶血性試驗。

本研究對咪唑苯脲注射液進行了溶血性試驗，結果表明咪唑苯脲注射液對受試兔紅細胞無溶血和凝聚現象，可供臨床注射使用。

近年來，動物原蟲病的發病率逐年上升，部分病已呈局部流行的趨勢。因此，在畜牧養殖過程中，抗原蟲藥對于動物原蟲病的預防及治療尤為重要。抗原蟲藥主要包括抗球蟲藥、抗錐蟲藥、抗梨形蟲藥、抗滴蟲藥四大類。抗球蟲藥主要分為三類。三嗪類的地克珠利和妥曲珠利，缺點為半衰期短且易產生耐藥性[23]。二硝基類的二硝托胺為產蛋期禁用的藥物；尼卡巴嗪的副作用較大，在體內蓄積時間長，因此在長休藥期期間可復發其他疾病，甚至造成死亡[24]。磺胺類藥物不適用于腎臟有疾病的畜禽，且不可長期連用；磺胺氯吡嗪的毒性較大，抗蟲譜較窄[24]。錐蟲病的主要傳播體是自然界的蜱蟲，喹嘧胺作為抗錐蟲藥物在家禽中應用較少[24]。巴貝西蟲病經蜱傳播，治療藥物有黃色素、貝尼爾、硫酸喹啉脲和咪唑苯脲。病牛服用黃色素后對光較敏感，強光照射易灼傷[25]；貝尼爾的副反應較大[26]；使用硫酸喹啉脲需特別注意妊娠奶牛可能發生流產。滴蟲為單細胞原蟲，火雞、鴿子、犢牛均可感染滴蟲病。抗滴蟲的藥物甲硝唑，在一些國家只允許用作治療藥物，不允許用作添加劑長期使用[27]。

1986年，Vos A J D的研究結果表明，咪唑苯脲作為一種有效預防牛巴貝斯蟲感染的藥物，對牛痘苗的傳染性有明顯的抑制作用，是一種有效的牛分枝桿菌化療藥物[28]。2019年，Ehimiyein A M的研究結果表明，犬巴貝斯蟲引起的行為和臨床血液學損傷的實驗感染，如口干、眼內有分泌物、脾腫大、貧血和血小板減少癥，在聯合應用咪唑苯脲和丙氨酸丙咪唑的情況下得到了最佳的改善，是治療犬巴貝斯蟲病的有效藥物[29]。但國內外當前沒有關于咪唑苯脲注射液臨床使用有關全部特殊安全性研究報告。

本研究通過豚鼠和新西蘭大白兔進行的皮膚致敏、皮膚刺激、肌肉刺激、紅細胞溶血試驗結果表明，咪唑苯脲注射劑無皮膚刺激性、不出現過敏反應(致敏率為0)、無肌肉刺激性、無溶血和凝聚作用，未對受試動物產生明顯的不良影響，受試動物未見異常行為，臨床上可以肌肉注射使用，具有良好的應用前景。