3株雞傳染性貧血病毒的全基因組序列分析

鄧顯文，張民秀，謝芝勛，張艷芳，謝麗基，謝志勤，劉加波，羅思思，曾婷婷

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所, 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室, 南寧 530001)

雞傳染性貧血病(Chicken infection anemia, CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infection anemia virus, CIAV)引起的雞免疫抑制病，易感雛雞感染該病毒主要表現(xiàn)為再生性貧血障礙、骨髓萎縮和胸腺淋巴組織萎縮等癥狀[1]。我國于1992年首次在雞群中分離鑒定CIAV[2]，隨后在黑龍江省、安徽省、廣西省等地的雞群均檢測到CIAV的存在[3～5]。CIAV基因組全長約為2.3 kb，為單股負鏈DNA，含有3個開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)，分別是ORF1，ORF2和ORF3，依次編碼Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1) 和Viral protein 2(VP2)[6]。VP1蛋白是CIAV的核衣殼蛋白，并且是CIAV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白和主要免疫原蛋白，可刺激機體產(chǎn)生較高的中和抗體。VP2蛋白是CIAV的支架蛋白，并且是VP1蛋白的輔助蛋白，幫助VP1蛋白形成正確的構(gòu)像，從而使VP1蛋白暴露出中和表位[7]。VP3蛋白是CIAV的非結(jié)構(gòu)蛋白，又稱為凋亡素，具有誘導雞胸腺淋巴母細胞和原始造血細胞凋亡的作用，從而導致雛雞出現(xiàn)再生性貧血障礙癥[8]。

根據(jù)CIAV全基因組的遺傳進化規(guī)律，將CIAV主要分為4個基因群，分別是Group A、Group B、Group C和Group D[9-10]。目前研究顯示Group A在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是優(yōu)勢的基因群[11-13]。我國主要流行的基因群為Group A，雞群中散發(fā)存在Group B 和Group D基因群[9]。解慧梅[14]在2012-2104年間對江蘇省雞群CIA進行了血清學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血清抗體陽性率平均達到31.9%。儲鴻蒙[15]對安徽省CIA血清學調(diào)查顯示，血清陽性率達63.6%。這些數(shù)據(jù)再一次證實了我國CIAV感染雞群的廣泛性。本研究分別于2018年1月、4月和8月在廣西南寧市規(guī)模化雞場采集到3份病雞肝臟組織樣品，運用CIAV的檢測引物鑒定為CIAV陽性后，分段擴增CIAV的基因組，并進行測序后將分段擴增的目的片段進行拼接，獲得3株CIAV的全基因組，對這3株CIAV的基因組進行序列分析，以期獲得廣西南寧市CIAV流行毒株的分子變異趨勢，為進一步豐富CIAV的分子流行病學提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源及CIAV PCR鑒定 2018年1月、4月和8月份于廣西南寧市規(guī)模化雞場商品代肉雞采集到3份肝臟組織。樣品處理：磷酸緩沖溶液(PBS)按照(肝臟：PBS)1∶5稀釋混成勻漿，將勻漿吸入到EP管中，反復凍融3次，3000 r/min離心20 min，取上清液并-70 ℃保存?zhèn)溆茫贿\用參考文獻[16]中的引物鑒定這3份病料均為CIAV陽性。

1.2 主要試劑 分子克隆所需試劑盒EasyPure Genomic DNA kit、DH5α感受態(tài)細胞和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T、TaKaRa Ex Taq和DL2000 Maker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 CIAV全基因擴增引物 擴增CIAV全基因引物如表1，引物由華大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 病料DNA的提取 3份陽性CIAV組織樣品的DNA按照EasyPure Genomic DNA kit的操作說明書提取，提取好的DNA于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CIAV全基因的擴增及序列分析 將提取好的DNA參照TaKaRa Ex Taq操作說明進行CIAV全基因的擴增。PCR產(chǎn)物進行電泳純化后按照常規(guī)操作進行基因克隆，挑取陽性克隆菌液送華大基因生物科技(深圳)有限公司測序。應用LaserGene7.1對獲得的序列進行拼接、拼接完成后運用LaserGene7.1和MEGA 4.0 軟件對CIAV全基因序列的核苷酸、VP1、VP2和VP3蛋白氨基酸序列進行分析，并構(gòu)建CIAV全基因、VP1、VP2和VP3基因的遺傳進化樹。從GenBank上獲得28條CIAV全基因序列，其中包括13條國外參考毒株的全基因序列，15條國內(nèi)參考毒株的全基因序列。

2 結(jié) 果

2.1 CIAV全基因擴增和序列測定結(jié)果 應用CIAV分段擴增引物對3份陽性CIAV的全基因進行分段擴增，擴增產(chǎn)物大小分別約為872、907和1254 bp，見圖1。3株CIAV基因組經(jīng)過基因測序鑒定后，運用LaserGene7.1對3段基因進行拼接后，3條全基因序列大小均為2298 bp，將3株CIAV進行命名，分別是GX1801、GX1804和GX1810，將序列上傳至GenBank基因庫，得到的相應序列號，分別是MK484614、MK484615和MK484616。

M: 100bp ladder; 1: 陰性對照; 2-4: 872bp片段；5-7: 907bp片段; 8-10: 1254bp片段M: 100bp ladder; 1: Negative control; 2-4: 872bp fragments；5-7: 907bp fragments; 8-10: 1254bp fragments

2.2 3株CIAV全基因序列同源性分析及遺傳進化分析 GX1801、GX1804和GX1810全基因核苷酸序列之間的同源性為99.3%～99.7%，與28株參考毒株的核苷酸同源性為95.6%～99.8%；GX1801、GX1804和GX1810全基因序列與參考毒株的遺傳進化分析表明(圖2)，CIAV遺傳進化樹可分為4個基因群，分別是Group A、Group B、Group C和Group D，所參考的中國毒株分別分布在Group A、Group B和Group D群；本研究的3株CIAV與12株中國參考毒株同屬于Group A，并與GD-104和GD-103的親緣關(guān)系最近，同源性在99.3%～99.9%；該結(jié)果說明了國內(nèi)的CIAV流行毒株主要以Group A基因群為主(圖2)。根據(jù)遺傳進化樹的基因分群，將本研究3株CIAV全基因序列分別與屬于Group A、Group B、Group C和Group D的參考毒株進行核苷酸進行同源性分析，結(jié)果顯示與Group A的參考序列間的核苷酸同源性為96.5%～99.8%；與Group B的參考序列間的核苷酸同源性為97.7%～98.2%；與Group C的參考序列間的核苷酸同源性為96.2%～96.9%；與Group D的參考序列間的核苷酸同源性為95.6%～96.5%。

圖2 CIAV全基因遺傳進化樹

2.3 運用VP1基因、VP2基因和VP3基因構(gòu)建進化樹的結(jié)果比較 比較基于VP1、VP2和VP3基因構(gòu)建的遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)基于VP1構(gòu)建的遺傳進化樹可分為Group A、Group B、Group C和Group D 4個基因群，并且與基于CIAV的全基因進化樹分群相一致，而VP2和VP3的遺傳進化樹僅能分為Group A、Group B、Group C或Group A、Group D、Group C(圖3)；以上數(shù)據(jù)說明CIAV的分群可依據(jù)VP1基因進行區(qū)分。

2.4 GX1801、GX1804和GX1810 VP1、VP2和VP3氨基酸序列分析 將本研究獲得毒株和28株參考毒株的VP1蛋白的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)VP1蛋白的變異主要集中在第75、97、125、139、144、287、370、376、413和447位氨基酸位點；GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白與28株參考毒株的氨基酸同源性為96.8%～100%，其中與GD-103 和GD-104的氨基酸同源性為99.8%～100%；分析GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白高變區(qū)(139aa～151aa)發(fā)現(xiàn)，3個毒株在該區(qū)域沒有出現(xiàn)氨基酸位點的增加和缺失，并且具有高度保守的特性；分析VP1蛋白上與毒力相關(guān)的氨基酸位點(第75、89、125、141、144、394位氨基酸位點)，發(fā)現(xiàn)GX1801、GX1804和GX1810與國外強毒株Cuxhaven-1在第75、89、141、394位氨基酸位點上保持一致，與弱毒株C369僅在第394位氨基酸存在差異；與日本強毒株C368、國內(nèi)強毒株GD-103和GD-104株在第75、89、125、141、144、394位氨基酸位點全部一致，推測GX1801、GX1804和GX1810與日本強毒株C368、國內(nèi)強毒株GD-103和GD-104株可能具有相似的致病性(表2)。

圖3 基于VP1、VP2和VP3基因構(gòu)建的遺傳進化樹

本研究中VP2蛋白氨基酸序列比對結(jié)果顯示VP2蛋白上氨基酸位點的變異較少，說明VP2蛋白氨基酸序列高度保守，GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白與28株參考毒株的氨基酸同源性為98.6%～100%；其中與GD-103 和GD-104的氨基酸同源性為99.5%～100%；GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上與磷酸酶活性相關(guān)的基序(I94CNCGQFRKH103)均未發(fā)生變異。比較所有VP3蛋白的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP3蛋白的氨基酸序列高度保守，未見有明顯的變異；GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白與28株參考毒株的氨基酸同源性為96.7%～100%；其中與GD-103 和GD-104的氨基酸同源性均為100%；分析GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白與誘導細胞凋亡相關(guān)的重要區(qū)域(VP3蛋白N端結(jié)構(gòu)域的第1-69位氨基酸)，發(fā)現(xiàn)這個區(qū)域高度保守。

表2 GX1801、GX1804、GX1810和Cuxhaven-1、C368、C369、GD-103、GD-104間的氨基酸位點變化

3 討 論

蔣玲艷[5]于2002-2004年間對廣西雞群的CIAV的感染情況進行了流行病學調(diào)查，并證明CIAV在廣西雞群中普遍存在。鄧顯文等[17]于2006年對一株廣西CIAV分離株進行遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與天津株TJBD40親緣關(guān)系較近。近年來，未見有關(guān)于廣西CIAV的流行情況的報道，本試驗從臨床組織樣品中擴增并獲得3株廣西南寧CIAV的全基因序列，為廣西CIAV的分子流行病學調(diào)查提供了重要材料。

本研究參考Eltahir等[9]對CIAV的分群，將CIAV遺傳進化樹分為4個基因群(Group A、Group B、Group C和Group D)，國內(nèi)所參考的15株中國毒株分別分布在Group A、Group B和Group D群，與Eltahir Y M的研究相一致，本研究的GX1801、GX1804和GX1810毒株與12株中國參考毒株同屬于Group A，再次證實了國內(nèi)流行毒株主要以Group A群為主，并且GX1801、GX1804和GX1810毒株與國內(nèi)毒株GD-103、GD-104的親緣關(guān)系較近，其與GD-103、GD-104具有較高的氨基酸同源性，因此,推測GX1801、GX1804和GX1810毒株可能與GD-103、GD-104來源于同一毒株。本研究比較了基于CIAV全基因、VP1基因、VP2基因和VP3基因構(gòu)建的進化樹，發(fā)現(xiàn)CIAV全基因和VP1基因所構(gòu)建的進化樹相一致，而基于VP2基因和VP3基因構(gòu)建的進化樹不能夠更細致的分群，因此基于VP1基因?qū)IAV進行分群給CIAV在基因群上的劃分上帶來一定的指導意義。

CIAV的致病性和在細胞上的增殖、復制與VP1蛋白的氨基酸位點關(guān)系密切。Renshaw 等[18]發(fā)現(xiàn)VP1上第139和第144位氨基酸位點均突變?yōu)楣劝滨０?Q)時，會降低病毒在MACC-MSB1細胞上的增殖和傳播效率。GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上第139和144的氨基酸位點分別為賴氨酸(K)和谷氨酸(E)，而與之比較的C368和C369株均能在MACC-MSB1細胞上增殖并具有較高的病毒效價[19]，因此，推測GX1801、GX1804和GX1810可能在MACC-MSB1細胞上具有很好的適應性。Todd等[20]對Cuxhaven-1株VP1蛋白位點第75、89、125、141、144都進行了突變，但仍然保留394位氨基酸為谷氨酰胺(Q)，發(fā)現(xiàn)該Cuxhaven-1突變株毒力減弱，并且不能引起貧血、骨髓和胸腺萎縮。本研究中參考的C368和C369株已經(jīng)經(jīng)過Yamaguchi等[19]的鑒定，分別是具有高致病性強毒株和低致病性的弱毒株，而國內(nèi)毒株GD-103和GD-104毒株也已經(jīng)經(jīng)過藺文成等[21]鑒定為強毒株，GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白在毒力相關(guān)位點(第75、89、125、141、144和394位)上均與C368、GD-103和GD-104在同位點上保持一致，因此，推測本研究中的GX1801、GX1804和GX1810株可能具有高致病性，但需要進一步的人工感染試驗才能確定。

CIAV 的VP2蛋白具有雙重特異性磷酸酶活性，與磷酸酶活性相關(guān)的基序是位于VP2蛋白上第94～103位氨基酸(I94CNCGQFRKH103)，基序內(nèi)的第95位和第97位氨基酸的突變會減弱病毒在MDCC-MSB1細胞上的復制能力和減少細胞病變[22]。本研究中GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上的I94CNCGQFRKH103高度保守，這是否能夠?qū)е翸DCC-MSB1細胞上產(chǎn)生明顯的細胞病變還需要進一步研究。Astrid等[23]研究發(fā)現(xiàn)，VP3蛋白與誘導腫瘤細胞凋亡相關(guān)的重要區(qū)域是位于N端結(jié)構(gòu)域的第1～69位的氨基酸位點，該區(qū)域的缺失不能誘導腫瘤細胞的凋亡。本研究中GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白 N端結(jié)構(gòu)域的第1～69位氨基酸均高度保守，結(jié)合VP1毒力相關(guān)位點的分析，推測GX1801、GX1804和GX1810在感染雞體后可能能夠引起雞類淋巴細胞和骨髓細胞的凋亡。