長效土霉素注射液的急性毒性及肌肉刺激性研究

任含柳,路美玉,段鵬,黃月輝

(華北制藥集團動物保健品有限責任公司，石家莊 050000)

長效土霉素注射液屬四環素類抗生素，具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、衣原體、支原體及立克次體均有效，臨床也常用于治療附紅細胞體等病，并且能夠維持較長有效血藥濃度時間。其作用機制主要在于藥物可以特異性地與核糖體30S亞基的a位置結合，從而阻止氨基酰-tRNA在該位置上的聯結，進而抑制肽鏈的增長和影響細菌或其他病原微生物的蛋白質合成。20世紀美國輝瑞制藥公司率先開發成功長效土霉素注射液，其商品名為“得米先”，上市后迅速得到普及。近些年來，我國也成功研制出了長效土霉素注射液，但同國外產品相比仍有較大的差距，主要表現在穩定性差、工藝控制難等問題[1]，這就大大降低了國內相關產品的市場競爭力[2]。為提高長效土霉素注射液的緩釋作用，同時克服長效土霉素注射液的穩定性缺陷，本文通過預試驗篩選有機復合溶劑、緩釋劑、抗氧劑、穩定劑及pH調節劑，確定采用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、聚乙烯吡咯烷酮K30等有機溶媒，經過特殊工藝制備，得到一種新型的長效土霉素注射液。前期試驗表明，該長效土霉素注射液成本低、穩定性好[3]。為探討該長效土霉素注射液的急性毒性及刺激性，本研究分別進行了小鼠急性毒性和家兔局部刺激性試驗，以期為臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品 長效土霉素注射液，由華北制藥集團動物保健品有限責任公司研發部實驗室制備。均用滅菌生理鹽水稀釋至適宜倍數后使用。

1.2 試驗動物及管理 選取60只健康昆明種小白鼠(雌雄各半)，體重為19±2 g，試驗動物及飼料均購自沈陽市雙義試驗動物研究所。選取27只健康成年家兔(雌雄各半)，體重為2.0～2.5 kg，試驗動物及飼料均購自新疆醫藥大學實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性毒性試驗 試驗實施時間為2018年9月10日至2018年9月17日，試驗場地為石家莊市某大學實驗室。隨機將60只小白鼠分為6組，每組10只，其中雌雄各半。根據預試驗初步確定出LD0和LD100分別為408.7、759.7 mg/kg，確定正式試驗分別以408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg的劑量，給小白鼠按照0.1 mL/10 g進行頸部肌肉注射。試驗期為7 d，各組以相同日糧及飲水常規飼養。

1.3.2 家兔局部刺激性試驗 試驗實施時間為2018年9月15日至2018年9月29日，試驗場地為石家莊市某大學實驗室。隨機將27只家兔分為3組，每組9只。左側股四頭肌部位剪去兔毛，用75%乙醇和2%碘酊消毒后，分別在第一組成年家兔的左側后股四頭肌處注射滅菌生理鹽水1.00 mL作對照，在第二組成年家兔的左側后股四頭肌處注射長效土霉素注射液0.5 mL，在第三組成年家兔的左側后股四頭肌處注射長效土霉素注射液1.00 mL。試驗期為15 d，各組以相同日糧及飲水常規飼養。

1.4 樣品采集及處理

1.4.1 急性毒性試驗 小白鼠頸部肌肉注射長效土霉素注射液后，觀察7 d并記錄每組臨床癥狀和死亡情況，隨機解剖5只小白鼠進行取樣，觀察肝臟、腎臟、心臟等內臟器官的變化情況。本試驗采用改良寇氏法[4]。按照毒理學分級標準進行評定。

1.4.2 刺激性試驗 成熟家兔注射后，每組分別于給藥后2、7、15 d各處死3只，解剖后取股四頭肌，縱向切開。觀察注射部位肌肉組織的變化。

本試驗采用成年家兔股四頭肌法。按照肌肉組織刺激反應的評定標準[5]進行評定， 0級刺激反應，給藥部位無明顯反應；1級刺激反應，給藥部位輕度充血，直徑0.5 cm以下；2級刺激反應，給藥部位中度充血，直徑1.0 cm以下；3級刺激反應，給藥部位中度充血，紅腫，肌肉有變性；4級刺激反應，出現肌肉褐色變性，壞死0.5 cm以下；5級刺激反應，肌肉嚴重變性，出現大片壞死。

1.5 數據分析 數據處理采用SPSS 17軟件進行One-Way ANOVA 方差分析，并用 Duncan 法進行多重比較，以P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗 結果如表1所示。

表1 長效土霉素注射液急性毒性試驗小白鼠死亡數(n=10)

由表1 可知，試驗小白鼠共6組，每組10只。6組小白鼠給藥劑量分別為408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg，觀察7 d后，各組死亡數(死亡率)分別為0只(0%)、2只(20%)、3只(30%)、4只(40%)、6只(60%)、9只(90%)。隨著給藥劑量的增大，小白鼠死亡數量逐漸增多。

表2 長效土霉素注射液急性毒性試驗

LD50為半數致死量

由表2可知，該新型長效土霉素注射液的LD50為600.32 mg/kg，LD50的95%的可信區間為(600.32±2.44)mg/kg。

2.2 局部刺激試驗 眼觀給藥后2、7、15 d，頸部注射部位無腫脹，觸摸無硬結。由表3可知，剖殺后取股四頭肌，對注射部位肌肉組織的刺激性反應分級。注射滅菌生理鹽水的家兔肌肉組織與正常肌肉組織相同；注射長效土霉素2 d后，注射部位出現充血、紅腫等刺激性反應癥狀；隨著時間延長和給藥劑量增加，刺激性增強，注射長效土霉素7 d后家兔股四頭肌出現紅腫、發紫、壞死、光澤消失現象，15 d后肌肉組織的壞死范圍擴大。

表3 長效土霉素注射液家兔股四頭肌刺激試驗結果

“+”為有刺激性，數量越多刺激性越大；“-”為無刺激性。

3 討論與結論

由于長效土霉素注射液的臨床用法是肌肉注射給藥，而安全性評價的指標又是以劑型為依據進行選擇的。因此，選擇了急性毒性試驗和局部刺激性試驗作為安全性評價指標。根據參考土霉素過量使用對肝臟、腎臟所造成的毒副作用的資料[6]，小白鼠會出現食欲減退、精神沉郁和運動失調；肝臟腫大，呈黃褐色，有出血點，易碎有油膩感；腎臟腫大，有出血點，易碎；部分小白鼠心臟稍有腫大，產生心包積液等癥狀。劉偉[7]等試驗研究表明，給小鼠以465.2 mg/kg劑量注射長效土霉素注射液時，小鼠出現精神沉郁、被毛粗糙、嗜睡等癥狀，對小鼠進行剖檢，發現小鼠肝臟腫大，呈黃褐色；腎臟腫大，有出血點；部分小鼠出現心臟稍有腫大，產生心包積液。在本試驗中，給小白鼠注射新型長效土霉素注射液的劑量為462.6 mg/kg時，同樣出現以上相類似的病發癥狀。且隨著給藥劑量的增大，癥狀越明顯。因此，這表明致小鼠死亡的主要原因為土霉素使用過量。

根據毒理學分級標準，藥物LD50在500～5000 mg/kg為低毒。季進英[8]等利用小白鼠檢測一種長效土霉素注射液的急性毒性試驗中，測得LD50為594.58 mg/kg，LD50的95%的可信限是594.58±2.22 mg/kg。根據毒理學分級標準其將長效土霉素注射液定為低毒。而本試驗測得新型長效土霉素注射液的LD50為600.32 mg/kg，LD50的95%的可信區間為(600.32±2.44)mg/kg。同樣在低毒范圍內，該結果與資料試驗所得結果一致。且該新型長效土霉素注射液的LD50偏高，說明相同致死率，該新型長效土霉素注射液需用更高的劑量，由此證明該新型長效土霉素注射液的處方工藝更優異，藥品的急性毒性更小。

季進英[8]等利用家兔檢測長效土霉素注射液的局部刺激性試驗中，給藥2、7、15 d后，眼觀無腫脹，手摸注射部位無硬結，解剖發現2 d后肌肉組織出現充血、紅腫現象；7 d后肌肉組織出現發紫、壞死；15 d后肌肉組織壞死范圍擴大。根據家兔股四頭肌刺激反應評價標準內容，由此判斷長效土霉素注射液對家兔具有局部刺激性。在本次試驗的給藥劑量條件下，表明該藥對肌肉組織有一定程度的刺激性，這與目前有關長效土霉素注射液具有局部刺激作用的報道一致[9-10]。

該新型長效土霉素注射液對小白鼠表現為低毒性，對家兔肌肉組織有一定程度的刺激性。