高效液相色譜法測定烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量

姜淋潔，崔志剛，楊 雪，婁艷華，甄盼盼，程雪嬌

(天津市中升挑戰生物科技有限公司，天津300080)

烯丙孕素(Altrenogest)是一種人工合成的甾類促孕激素，屬于19-去甲睪酮類化合物[1-2]，它可憑借其脂溶性穿透靶細胞，與特定受體結合[3-5]。烯丙孕素已被歐盟和美國批準用于母豬和母馬的同步發情，由其制成的口服液已成功上市。在我國獸醫臨床中，烯丙孕素口服液可用于母豬的同期發情、促進乏情母豬的發情[6-8]。但對于烯丙孕素口服液的質量控制，目前還沒有相關的研究報道，本研究建立烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量液相方法檢測方法，為烯丙孕素口服液的質量控制研究提供技術支撐。中國獸藥典中性激素類藥物如丙酸睪酮注射液采用乙醚溶解、甲醇提取后用高效液相色譜法測定丙酸睪酮的含量[9]，操作步驟繁瑣且對浪費大量有機溶劑。本研究對前處理方法進行改進，采用高效液相色譜法對烯丙孕素進行定性和定量檢測，方法經濟快速，可以滿足日常檢測需求。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1260 II 高效液相色譜儀包括包括G7111A四元泵，G7129A自動進樣器，AT-330柱溫箱，G7115A DAD檢測器，C.01.07 SR2(255)色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司；ES225SM-DR電子天平，普利賽斯儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山儀器有限公司；真空泵，ASL儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 烯丙孕素對照品(批號1708001，含量99.95%，天津市中升挑戰生物科技有限公司)，烯丙孕素口服液(批號：1709001，天津市中升挑戰生物科技有限公司)，正己烷(色譜純，西隴化工科技有限公司)，異丙醇(色譜純，西隴化工科技有限公司)。

1.3 色譜條件 以氰基鍵合硅烷為填充劑的Zorbax CN色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以正己烷-異丙醇(98∶2)為流動相；檢測波長為235 nm；流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 樣品溶液制備 精密稱取烯丙孕素口服液適量(約相當于烯丙孕素12.5 mg)，置25 mL棕色量瓶中，加異丙醇5 mL，超聲3 min使溶解，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取烯丙孕素對照品約25.0 mg，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加異丙醇5 mL溶解后，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2 系統適應性試驗 按照2.1項方法操作，配制1份對照品溶液，連續進樣5次。結果顯示，主峰峰面積的相對標準偏差為0.21%，主峰保留時間的相對標準偏差為0.60%，主峰的理論塔板數都在15000以上。結果見表1，色譜圖見圖1。系統適應性試驗表明該色譜條件可以滿足分析要求。

表1 系統適應性試驗結果

圖1 烯丙孕素對照品色譜圖

2.3 專屬性試驗 按照烯丙孕素口服液處方量配制空白制劑樣品，按2.1項中制備方法制成陰性對照溶液；另取烯丙孕素口服液按2.1項中制備方法制成供試品溶液；另稱取適量烯丙孕素對照品，按2.1項中制備方法制成對照品溶液。按1.3項的色譜條件分別進陰性對照、供試品溶液和對照品溶液，色譜圖見圖2，結果表明輔料成分不干擾樣品中烯丙孕素的測定。

圖2 專屬性試驗色譜圖(A、B、C 分別為對照品、供試品、陰性對照)

2.4 線性關系考察 分別精密稱取適量烯丙孕素對照品至50 mL容量瓶中，制成0.401、0.451、0.503、0.551、0.601 mg/mL的對照品溶液，按照1.3項色譜條件進樣記錄峰面積，以峰面積對進樣濃度作線性回歸，方程為y=8551.6x+101.78 (R=0.9998，n=5)，表明烯丙孕素對照品溶液濃度在0.401～0.601 mg/mL范圍內時與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 回收率試驗 按照烯丙孕素口服液處方分別配制9份50 mL空白制劑，然后加入主藥烯丙孕素處方量的80%(0.16 g)、100%(0.2 g)、120%(0.25 g)(每個濃度各3份)制備9份回收率樣品溶液，按2.1項中制備方法制成供試品溶液；另稱取適量烯丙孕素對照品，按2.1項中制備方法制成對照品溶液。按照1.3項色譜條件進樣，記錄色譜圖。計算樣品的回收率，結果見表2。

2.6 精密度試驗 按照2.1項方法操作，配制6份相同濃度(0.5 mg/mL)的烯丙孕素口服液樣品溶液和1份烯丙孕素對照品溶液。按照1.3項色譜條件進樣，記錄色譜圖見圖3。計算樣品中烯丙孕素的含量，結果見表3。

表2 烯丙孕素口服液中烯丙孕素的回收率(%)

表3 烯丙孕素口服液含量測定精密度試驗結果

圖3 精密度試驗色譜圖(A、B 分別為對照品、供試品)

2.7 定量限試驗 取烯丙孕素對照品約25 mg適量置于50 mL容量瓶中，按2.2項方法操作，得到濃度約為0.5 mg/mL的溶液，然后用正己烷逐步稀釋至濃度為804.9 ng/mL，連續測試6次，信噪比平均為10.2，因此，烯丙孕素定量限為804.9 ng/mL。

3 討論與結論

關于烯丙孕素在動物組織樣品中的殘留檢測國內外有很多報道，Elin Beckman等[10]利用液質聯用技術測定烯丙孕素和它的代謝物在馬尿液中的殘留水平。Martina Rejtharova等報道了利用液質聯用技術測定烯丙孕素等六種孕激素在腎臟脂肪中的殘留水平[11]。Dan Zhang等利用液質聯用技術測定烯丙孕素等在豬肉中的殘留水平[12]。Machnik等利用液質聯用技術測定烯丙孕素在馬血漿和馬尿液中殘留水平[13]。康海寧等建立了河豚魚、鰻魚及烤鰻中烯丙孕素與氯地孕酮殘留的同時測定的超高效液相色譜-串聯質譜法[14]。林黎明等建立了進出口動物源性食品中孕激素類藥物殘留量的高效液相色譜串聯質譜檢測方法[15]。邵兵等建立了動物源食品中激素多殘留檢測方法液相色譜-質譜/質譜法[16]。賀利民等建立了動物源食品中11種激素殘留檢測液相色譜-串聯質譜法[17]。這些研究者都是將烯丙孕素從組織樣品中提取出來，然后運用液質等手段對烯丙孕素進行定量測定，操作過程繁瑣且對設備要求比較高。本文建立的烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量測定方法，著重對前處理方法和色譜系統進行改進，以期為企業實際生產中烯丙孕素制劑的質量控制提供依據。

3.1 樣品前處理方法的選擇 烯丙孕素易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，難溶于水，其在花生油、大豆油等植物油中有較大溶解度，故烯丙孕素口服液常用植物油作為載體輔料。當制劑樣品以植物油作為載體輔料進行含量測定時，須先將主藥成分提取出來再進行測試，如用乙醚溶解后再用甲醇多次提取[9]，不僅需要經過繁瑣的步驟，還耗費大量的有機溶劑，而且處理過程過多會造成樣品損耗，進而導致測量誤差。本研究中采用異丙醇-正己烷(5/20)作為混合溶劑，不但能將主藥成分和輔料載體完全溶解，而且操作簡單便于控制，避免了復雜的前處理步驟。

3.2 色譜系統的選擇 傳統的液相色譜系統常用非極性物質(如C18)作為固定相，以甲醇/水或者乙腈/水這些極性大的溶劑作為流動相進行洗脫。在本研究中由于樣品前處理過程中用到異丙醇-正己烷(5/20)作為混合溶劑，混合溶劑的極性比較小，須選用極性大的物質(如氰基鍵合硅膠)為固定相、極性小的物質(如正己烷-異丙醇混合體系)為流動相的正相色譜系統進行分析。

本方法測定烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量，無需復雜的樣品處理和特殊試劑，測定方法專屬性強、準確度高、試劑成本低，便于生產中的質量檢測。