高效液相色譜法測定麻杏石甘顆粒中鹽酸麻黃堿含量

米彥飛，侯麗麗，武晉孝，郭禹

(山西省畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測中心，太原 030027)

麻杏石甘顆粒收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版中藥卷，處方由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草組成，具有清熱化痰、止咳平喘功能，主治肺熱咳喘[1]，處方中麻黃為君藥。麻黃為麻黃科植物草麻黃(Esinica)、木賊麻黃(E.equisetina)或中麻黃(E.intemedia)的干燥草質(zhì)莖[2]。鹽酸麻黃堿是中藥麻黃的主要成分，具有解熱、抗過敏、興奮中樞神經(jīng)與松弛支氣管平滑肌等多種有效藥理作用[3]，屬于國家規(guī)定嚴(yán)格管控的藥物[4]，使用不當(dāng)可產(chǎn)生多種毒副作用[5]。鹽酸麻黃堿有多種檢測方法，如分光光度法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法、電位測定法等[6]，但未有專門針對(duì)麻杏石甘顆粒中鹽酸麻黃堿的定量檢測方法。《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中麻杏石甘顆粒項(xiàng)下僅有薄層色譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)，未有鹽酸麻黃堿的含量測定項(xiàng)。為進(jìn)一步提高麻杏石甘顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床效果，減少毒副作用，本試驗(yàn)對(duì)高效液相色譜測定麻杏石甘顆粒中鹽酸麻黃堿含量方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 Agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)，紫外檢測器/G1314，原裝色譜工作站，四元梯度泵/G1311C，自動(dòng)進(jìn)樣器/G1329B，柱溫箱/G1316A，購于安捷倫科技有限公司。TB-215D型電子天平，購于美國丹佛公司。

1.2 材料與試劑 鹽酸麻黃堿對(duì)照品，批號(hào)171241-201508，純度99.8%，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。麻杏石甘顆粒(批號(hào)201805001)，100 g/袋，保定冀中藥業(yè)有限公司制樣。陰性樣(缺麻黃的麻杏石甘顆粒)(批號(hào)201805001)，100 g/袋，保定冀中藥業(yè)有限公司制樣。乙腈為色譜級(jí)，磷酸、三乙胺、鹽酸為分析純，水為超純水。

1.3 色譜條件 色譜柱：Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97，V/V)；紫外檢測器：檢測波長207 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶液稀釋，制得120 μg/mL鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液，搖勻。將所得溶液用流動(dòng)相按比例稀釋，制得60、40、20、10、5 μg/mL鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液，搖勻，0.22 μm濾膜濾過。

1.4.2 供試品溶液 準(zhǔn)確稱取麻杏石甘顆粒樣品1.0 g(精確至0.01 g)，置50 mL量瓶中，加水3 mL微溫使溶解，加濃氨溶液1 mL，加三氯甲烷定容至刻度，精密稱重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，振搖，過濾，取續(xù)濾液25 mL，加入5%鹽酸乙醇溶液4 mL，水浴蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶液溶解，定容至25 mL容量瓶，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。

1.4.3 陰性樣品溶液 準(zhǔn)確稱取不含麻黃的麻杏石甘顆粒陰性樣品1.0 g(精確至0.01 g)，按1.3.2項(xiàng)方法制備，即得。

1.4.4 陽性添加樣品溶液 準(zhǔn)確稱取不含麻黃的麻杏石甘顆粒陰性樣品1.0 g(精確至0.01 g)，精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品，按1.4.2項(xiàng)方法制備，即得。重復(fù)制備6份。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖與陰性干擾試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度達(dá)到4.22，鹽酸麻黃堿峰保留時(shí)間為19.5 min，理論板數(shù)為22381，峰面積為183.1，峰寬0.30 min。陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上，無吸收峰。綜上所述，本方法色譜圖滿足試驗(yàn)要求，前處理方法可有效去除制劑中干擾雜質(zhì)(圖1)。

圖1 HPLC色譜圖(A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品)

2.2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖和鹽酸麻黃堿峰面積。結(jié)果顯示， 12 h內(nèi)供試品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.60%，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定(表1)。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 分別取1.4.1項(xiàng)60、40、20、10、5 μg/mL對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)，鹽酸麻黃堿含量(X-mg/mL)為橫坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為：y=23.659x+ 8.0002，R2= 0.9999。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在5～60 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與鹽酸麻黃堿含量呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 鹽酸麻黃堿線性關(guān)系圖

2.4 精密度試驗(yàn) 取20 μg/mL濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。以峰面積計(jì)算，鹽酸麻黃堿相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.70%，表明精密度良好，符合檢測要求(表2)。

表2 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批供試品按1.4.2項(xiàng)方法，重復(fù)配制6份供試品溶液，注入色譜儀，進(jìn)樣10 μL。結(jié)果表明，6份樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.20%，重復(fù)性符合檢測要求(表3)。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別取1.4.4項(xiàng)6份陽性添加樣品溶液注入色譜儀，各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。回收率=加對(duì)照品后測得的含量/實(shí)際所加對(duì)照品量×100%。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿的平均回收率為96.62%(n=6)，RSD為1.30%，回收率試驗(yàn)符合檢測要求(表4)。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測定 為了充分考慮不同批次產(chǎn)品的含量差異，以制定出切實(shí)可行的該制劑含量標(biāo)準(zhǔn)限度。使用本方法對(duì)市售麻杏石甘顆粒、新注冊(cè)麻杏石甘顆粒和自制樣(保定冀中藥業(yè)有限公司制樣)鹽酸麻黃堿含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示(表5)，樣品中鹽酸麻黃堿最低含量為0.31 mg/g，最高含量為1.07 mg/g，平均含量為0.58 mg/g。根據(jù)13批樣品檢測結(jié)果，綜合考慮確保安全、有效、質(zhì)量可控，建議本品的含量限度制定為：本制劑每l g含麻黃以鹽酸麻黃堿(C10H15NO·HCl)計(jì)，不得少于0.35 mg。

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法的選擇 鹽酸麻黃堿的提取方法主要分為兩類，第一類方法是考慮到鹽酸麻黃堿可溶于水、乙醇的特點(diǎn)，直接使用超純水超聲提取[7-8]、流動(dòng)相超聲提取[9]、醇提取[10]等，此類方法簡單快捷，缺點(diǎn)是干擾雜質(zhì)較多。第二類方法是在第一類方法基礎(chǔ)上增加有機(jī)相萃取操作，如乙醚萃取[11]、二氯甲烷萃取[12]等。本試驗(yàn)從提高回收率、減少雜質(zhì)干擾、方法簡單可操作性三個(gè)方面對(duì)前處理方法進(jìn)行考察。由于麻杏石甘顆粒制劑成分復(fù)雜，使用第一類方法色譜圖上雜質(zhì)峰過多，無法滿足檢測要求，增加萃取步驟后則可顯著減少雜質(zhì)峰。綜合對(duì)比，本試驗(yàn)前處理方法為最優(yōu)選擇。

3.2 流動(dòng)相的選擇 高效液相色譜法測定鹽酸麻黃堿含量的流動(dòng)相主要有甲醇-磷酸系列[13]、乙腈-磷酸系列[14]以及甲醇-乙腈-磷酸系列[15]等。由于甲醇在210 nm的末端波長處有少量紫外吸收，使用乙腈替換甲醇，基線更加平穩(wěn)[9,16]，因此，主要考察乙腈-磷酸系列流動(dòng)相。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈和0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)比例在1∶99至5∶95范圍內(nèi)，均能實(shí)現(xiàn)鹽酸麻黃堿的良好分離。

3.3 色譜柱的選擇 《中國藥典》2010 年版(一部)和《中國獸藥典》 2015 年版(二部)麻黃項(xiàng)下對(duì)鹽酸麻黃堿的測定中均使用了極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱，該色譜柱價(jià)格較貴，使用率不高，未采納。本實(shí)驗(yàn)分別采用Syncroni AQC18(5 μm，4.6×150 mm)、Agilent XDB C18(5 μm，4.6×250 mm)和Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)三種不同的色譜柱進(jìn)行測定，均能有效分離目標(biāo)成分。經(jīng)峰形、峰拖尾、分離度、穩(wěn)定性等各方面比較后，Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱效果最好。

本研究所建立高效液相色譜法測定麻杏石甘顆粒中鹽酸麻黃堿含量的方法，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，簡便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、耐用性強(qiáng)，適用于麻杏石甘顆粒中鹽酸麻黃堿含量的測定，為麻杏石甘顆粒質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。