DNA免疫技術(shù)制備H10亞型禽流感病毒HA蛋白單因子血清的研究

高鑫鑫，郭晶，薛睿，趙聰慧，李旭勇

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000)

A型流感病毒為單股負鏈 RNA 病毒，根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)不同，可將流感病毒分為不同的亞型(H1～H18和N1～N11)。禽類作為流感病毒的混合器，除了從蝙蝠體內(nèi)分離的H17N10和H18N11兩種新型流感病毒[1-2]，其他所有亞型的流感病毒均可在禽類中分離得到。2013年我國江西省出現(xiàn)了全球首例人感染H10N8亞型流感病毒事件[3]，研究表明引起人感染的H10N8流感病毒(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)為一株三源重組病毒，HA基因來自H10N3病毒，NA基因來自H10N8病毒，6個內(nèi)部基因來自H9N2病毒。同樣是在江西省，Ma等[4]在2013-2014年的活禽市場的雞體內(nèi)共分離得到124株H10N8和H10N6禽流感病毒(Avian influenza viruses, AIVs)，遺傳演化分析表明H10N8 AIVs與致死的人源流感病毒(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)高度相似，證明家禽市場中雞體內(nèi)的流感病毒可能是人源病毒株的來源。Deng等[5]對2009-2013年在活禽市場分離出的8株H10N8 AIVs的研究表明，該亞型病毒對家禽無致病力，但可同時結(jié)合人源受體(α2, 6-SA)和禽源受體(α2, 3-SA)，且有4株病毒可引起小鼠體重下降約12.7%～22.5%。正是因為被感染動物的臨床癥狀較溫和，H10亞型AIVs常被人們所忽視，對其研究較少。為了有效監(jiān)測并消滅H10亞型AIVs，保障生物安全和公共健康，建立H10 AIVs的快速檢測方法具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

流感病毒亞型眾多，對不同亞型流感病毒的快速檢測一直是研究的熱點。流感病毒檢測技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附法、熒光定量PCR、普通PCR、血凝試驗和血凝抑制試驗等。由于血凝抑制試驗靈敏度高、特異性強、易于操作、價格低廉等特點，常作為流感病毒鑒定和檢測的首選試驗技術(shù)。目前，國內(nèi)用于H10亞型AIVs鑒定的抗體大多是全病毒制備的血清，由于其含有較多的抗體成分和非特異性物質(zhì)，進行流感病毒亞型鑒定時會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，造成假陽性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，為流感病毒亞型的鑒定帶來干擾。基于DNA免疫技術(shù)的單因子血清是將流感病毒某一種或某幾種蛋白克隆到真核表達載體后免疫動物而獲得單因子血清,本研究將H10N8 AIVs的HA基因經(jīng)雞偏嗜密碼子優(yōu)化后克隆至真核表達載體pCAGGs，免疫6周齡的SPF雞，從而獲得針對H10亞型血凝素的單因子血清，為H10亞型AIVs的快速鑒定和病毒抗原性精準(zhǔn)分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞、毒株和實驗動物 根據(jù)GenBank中的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)(KJ406543.1)HA基因序列進行雞偏嗜密碼子優(yōu)化后[6]，目的基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。感受態(tài)細胞購自北京全式金生物有限公司；pCAGGs載體由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院畜禽疫病防控技術(shù)創(chuàng)新團隊保存；293T細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。SPF雞購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI均購自New England Biolabs公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司。DMEM和胎牛血清均購自GIBCO公司。細胞裂解液購自Thermo Scientific公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光抗體購自Thermo Scientific公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗雞抗體購自KPL公司。

1.3 表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI分別對公司合成的目的基因、空載體質(zhì)粒pCAGGs進行雙酶切處理，用T4連接酶將載體和目的基因連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，挑取陽性菌落、擴大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI雙酶切獲得目的基因并測序。測序結(jié)果正確，將陽性質(zhì)粒命名為pCAGGs-H10，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞擴大培養(yǎng)，大量制備重組質(zhì)粒。

1.4 H10亞型禽流感病毒HA蛋白單因子血清的制備 取6只6周齡SPF雞，將已鑒定的表達質(zhì)粒pCAGGs-H10以每次200 μg/只的劑量對其肌肉注射，該區(qū)域進行電刺激，加強雞的應(yīng)激反應(yīng)。一免后第30天以相同劑量進行第二次免疫，二免后第30天以相同劑量進行第三次免疫，三免后的第10天心臟采血，分離血清，制備單因子血清。

1.5 H10N8 AIVs 血凝素蛋白與單因子血清的相互作用

1.5.1 間接免疫熒光試驗鑒定單因子血清 將表達質(zhì)粒pCAGGs-H10轉(zhuǎn)染至293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后固定細胞，用單因子血清作為一抗孵育后，加入帶有FITC標(biāo)記的兔抗雞的二抗，放于熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達。

1.5.2 western blot檢測單因子血清 表達質(zhì)粒pCAGGs-H10轉(zhuǎn)染至293T細胞，48 h后離心收集細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入適量的細胞裂解液，反復(fù)吹散細胞，在4 ℃孵育30 min，加入等量的2×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min。SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜后，用脫脂乳封閉膜，PBST洗膜后用H10單因子血清做為一抗孵育，PBST洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗雞二抗孵育，Odyssey儀器掃描，鑒定單因子血清效果。

1.6 H10亞型單因子血清的效價評估及特異性試驗

1.6.1 遺傳演化分析 在NCBI的流感數(shù)據(jù)庫中下載2012-2015年H10亞型AIVs的HA序列后，與A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的HA序列與進行遺傳演化分析。

1.6.2 血凝抑制試驗 以實驗室分離的流感病毒A/Duck/Shandong/203/2017 (H1N1)、A/Chicken/Shandong/10/2018 (H3N2)、A/Chicken/Shandong/423/2016 (H4N6)、A/ Chicken /Jiangxi/683/2016(H5N1)、A/Chicken/Shandong/1831/2016 (H6N2)、A/Goose/Shandong/3/2019 (H9N2)、A/Chicken/Shandong/146/2018 (H10N6)、A/Chicken/Shandong/23/2017 (H10N8)和新城疫病毒NDV/Chicken/Shandong/2008/2017為抗原，與制備的H10單因子血清和實驗室保存的H5、H9單因子血清進行血凝抑制試驗，同時以PBS作為對照，檢驗H10亞型單因子血清的特異性和交叉反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定 將表達質(zhì)粒pCAGGs-H10用限制性內(nèi)切酶EcoR I+XhoI于37 ℃酶切2 h后，得到1700 bp的HA基因片段(圖1)，將該片段收回測序，測序結(jié)果正確，表明表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：表達質(zhì)粒pCAGGs-H10；2：表達質(zhì)粒pCAGGs-H10的雙酶切片段M: DL5000 DNA Marker; 1: Recombinant plasmid pCAGGs-H10;2:Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pCAGGs-H10

2.2 HA蛋白與單因子血清的相互作用

2.2.1 間接免疫熒光試驗結(jié)果 熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCAGGs-H10的293T細胞產(chǎn)生特異性綠色熒光，轉(zhuǎn)染空載體的293T細胞檢測不到熒光(圖2)，表明真核重組表達質(zhì)粒能夠表達H10N8 AIVs的血凝素蛋白，并且該目的蛋白與制備的單因子血清相互作用。

2.2.2 western blot檢測結(jié)果 檢測發(fā)現(xiàn)血凝素蛋白在75 ku處表達(圖3)，該蛋白與單因子血清相互作用，表明單因子血清制備成功。

A：表達質(zhì)粒pCAGGs-H10轉(zhuǎn)染至293T細胞；B：空載體pCAGGs轉(zhuǎn)染至293T細胞A:Transfected pCAGGs-H10 into 293T;B:Transfected pCAGGs into 293T

1：表達質(zhì)粒pCAGGs-H10轉(zhuǎn)染至293T細胞；2：空載體pCAGGs轉(zhuǎn)染至293T細胞1: Transfected pCAGGs-H10 into 293T;2:Transfected pCAGGs into 293T

2.3 H10亞型HA單因子血清的特異性試驗

2.3.1 遺傳演化分析 H10亞型AIVs的HA基因主要分為歐亞譜系和北美譜系。應(yīng)用MAGE.7軟件對克隆的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8) 的HA序列進行比對，繪制基因進化樹。圖4結(jié)果顯示，克隆的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8) 的HA序列屬于歐亞譜系，并且該克隆株的HA序列與我國流行株高度同源。

圖4 HA基因的進化樹分析

2.3.2 血凝抑制試驗結(jié)果 實驗室分離的多株流感病毒和新城疫病毒NDV/Chicken/Shandong/2008/2017作為抗原，與制備的H10單因子血清進行血凝抑制試驗，結(jié)果只有A/Chicken/Shandong/146/2018 (H10N6)、A/Chicken/Shandong/23/2017 (H10N8)與H10單因子血清發(fā)生血凝抑制反應(yīng)，抗體效價分別為256、128，表明制備的H10亞型單因子血清與其他亞型AIVs無交叉反應(yīng)，針對目前我國國內(nèi)流行的H10亞型AIVs具有良好的特異性和敏感性。

3 討論與結(jié)論

近年來，禽流感的流行與暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重危害。2013年我國江西省出現(xiàn)了H10N8亞型流感病毒感染人并造成死亡的事件，使得該亞型流感病毒引起各界廣泛關(guān)注。H10N8亞型AIVs最早由Zhang等[7]分離于2007年我國洞庭湖水域，該病毒對哺乳動物小鼠無致病力，但在小鼠體內(nèi)傳代后獲得致病力，并且PB2-E627K、M1-M192V等多個氨基酸位點突變。研究表明，H10亞型AIVs除了雞、鴨等家禽中，在野生水禽也能檢出[7-9]，提示我們H10亞型低致病性AIVs在自然界中分布較廣。野鳥攜帶的病毒可能與家禽攜帶的病毒同時感染同一宿主，增大了不同毒株間發(fā)生基因重排乃至產(chǎn)生危害性更大的重組病毒的可能性[8]，正如感染人并致死的A/Jiangxi-Donghu/346/2013(H10N8) 三源重組病毒株。因此，應(yīng)該加強對H10亞型AIVs的監(jiān)測力度，預(yù)警該亞型病毒在自然界中的持續(xù)進化將會對生物安全和公共健康造成持續(xù)的潛在威脅。

表1 H10單因子血清與其他亞型AIVs和新城疫病毒抗原的血凝抑制試驗

本試驗將經(jīng)雞偏嗜密碼子優(yōu)化后的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)流感病毒的HA基因克隆到pCAGGs載體，免疫SPF雞后獲得單因子血清。間接熒光免疫試驗和western blot試驗結(jié)果表明，制備的H10亞型單因子血清可與HA蛋白相互作用，并且單因子血清的特異性試驗結(jié)果顯示該單因子血清只能與H10亞型的HA蛋白相互作用，與其他亞型AIVs以及其他種類病毒無相互作用，從而獲得特異性強、敏感性好、無交叉反應(yīng)的H10亞型單因子血清。這與傳統(tǒng)通過免疫滅活全病毒或直接免疫活病毒以獲取抗某種亞型血清的方式相比更具安全性，并且避免了使用全病毒免疫的血清進行HI試驗時，NA抗體會非特異性地干擾HA，從而導(dǎo)致非特異性血凝抑制現(xiàn)象的問題。目前，有關(guān)H10N8的遺傳進化分析的報道較少，不斷檢測分析H10亞型AIV在自然界中的分布及進化情況在H10亞型AIV于自然界中分布較廣、重組病毒株能夠感染人并致死的背景下，該H10亞型單因子血清的成功制備為H10亞型AIVs的檢測提供了有力支持。