3種不同類型佐劑的豬圓環(huán)病毒2型亞單位滅活疫苗免疫效果的比較研究

柴華,張智明，閆妍，方超，孫曉峰，梁宛楠，竇海艷，何世岷

(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirus type 2，PCV-2)感染可引起的豬的斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、母豬繁殖障礙等多種相關(guān)疾病[1-2],已在我國(guó)以及世界其他國(guó)家和地區(qū)普遍流行，我國(guó)最早則由朗洪武等[3]于2001年報(bào)道了PCV2的存在。目前我國(guó)大部分省市的豬場(chǎng)均有由PCV2感染引起的相關(guān)疾病的報(bào)道，且該病有不斷蔓延趨勢(shì)[4-6]。接種相關(guān)疫苗是預(yù)防由PCV2感染引發(fā)相關(guān)疾病的首要手段。當(dāng)前，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上生產(chǎn)和銷售的豬圓環(huán)病毒2型疫苗的類型主要為全病毒滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗等[7-8]，國(guó)外生產(chǎn)和銷售則主要為Cap亞單位疫苗[9-11]。亞單位疫苗具有全病毒滅活疫苗和全病毒弱毒活疫苗等不具備的優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)出現(xiàn)散毒、同源重組以及發(fā)生變異的可能性[12-13]，容易制備高純度和高效價(jià)的抗原以及制備的疫苗具有安全、可靠、高效的優(yōu)點(diǎn)，近年來成為我國(guó)PCV2疫苗的研究趨勢(shì)。而在亞單位疫苗的制備過程中，佐劑選擇的正確與否，對(duì)于疫苗的免疫效力存在著重要的影響。本試驗(yàn)嘗試用3種不同類型的佐劑制備疫苗，并對(duì)制備的疫苗進(jìn)行免疫效力的評(píng)價(jià)，以期為商品化亞單位疫苗佐劑的選擇提供重要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 佐劑及主要試劑 GEL 01佐劑購自Seppic公司；白油購自索諾邦公司；氫氧化鋁膠由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司自制。豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購自北京金諾百特科技有限公司。鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)購自Sigma公司，巰基乙酸培養(yǎng)基(Thio)、dNTPs、Taq酶購自Prornega公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 疫苗 疫苗A：豬圓環(huán)病毒2型亞單位滅活疫苗(GEL 01佐劑)；疫苗B：豬圓環(huán)病毒2型亞單位滅活疫苗(白油佐劑)；疫苗C：豬圓環(huán)病毒2型亞單位滅活疫苗(氫氧化鋁膠佐劑)，均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司提供，以上3種疫苗中豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的含量均為20 μg/mL，疫苗D：商品化豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)(佐劑為Seppic公司的ISA 15A佐劑，水包油型)，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備，批號(hào)：201802。

1.3 免疫保護(hù)試驗(yàn) 取30頭3～4周齡PCV2抗體陰性健康仔豬，隨機(jī)分為6組，每組5頭，第1組接種疫苗A，2 mL/頭；第2組接種疫苗B，2 mL/頭；第3組接種疫苗C，2 mL/頭。第4組注射疫苗D，2 mL/頭。以上疫苗免疫后21 d，以相同劑量加強(qiáng)免疫1次。第5組為攻毒對(duì)照組，第6組為空白對(duì)照組。免疫后每周采血，分離血清，用間接ELISA測(cè)定PCV2抗體。加強(qiáng)免疫后14 d，對(duì)第1～5組用PCV2攻毒(PCV2 LG株)，5.0 mL/頭(5×106.5TCTD50)，攻毒后第4、7日分別在每頭豬的兩腋下及臀部4點(diǎn)注射用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白4 mL(2 mg)，并同時(shí)腹腔注射10 mL巰基乙酸培養(yǎng)基；第11、19 日腹腔注射10 mL巰基乙酸培養(yǎng)基。隔離飼養(yǎng)，觀察21 d。攻毒后1～21 d，每日觀察臨床癥狀，測(cè)量體溫；攻毒前第1日和攻毒后第21日分別測(cè)量豬的體重，計(jì)算相對(duì)日增重率(日增重/原體重)；攻毒后21 d采血，用PCR方法檢測(cè)病毒血癥。攻毒后21 d將全部試驗(yàn)豬剖殺，觀察主要臟器的病理變化，并取股骨溝淋巴結(jié)進(jìn)行病理切片的分析。

1.4 PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[14]方法設(shè)計(jì)PCV2的引物序列如下：PCV F 5′-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3′；PCV R 5′-GCCAAGCTTT￣CACTTCGTAATGGTTTT-3′。引物由上海生物工程(上海)股份有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為75l bp。采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物(0.02 mmol)各1 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，rTaq DNA聚合酶( 2.5U)0.5 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃ 10 min，結(jié)束程序。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.5 血清PCV2抗體ELISA的測(cè)定 按照豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測(cè)試劑盒說明書的方法進(jìn)行血清抗體的測(cè)定，結(jié)果判定：樣品A值≥0.38為陽性；樣品A值在0.2～0.38之間為可疑；樣品A值<0.2為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同佐劑疫苗臨床癥狀的觀察結(jié)果 用3種不同佐劑制備的疫苗與商品化疫苗免疫豬后，不同組的免疫豬在精神狀態(tài)、采食等方面均為正常，注射部位無紅、腫等臨床癥狀，無全身不良反應(yīng)，表明分別用3種佐劑制備的疫苗對(duì)豬的不良反應(yīng)與商品化疫苗無顯著差異；用PCV2 LG株攻毒后，3種不同佐劑制備的疫苗與商品化疫苗免疫組均未出現(xiàn)厭食、精神不振、進(jìn)行性消瘦等臨床癥狀；攻毒對(duì)照組在攻毒后，有3頭豬出現(xiàn)厭食、精神不振及進(jìn)行性消瘦，同時(shí)體溫出現(xiàn)升高，出現(xiàn)發(fā)熱的情況；空白對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)期間臨床癥狀、體溫一直保持正常。

2.2 相對(duì)日增重的測(cè)定結(jié)果 在攻毒前第1日和攻毒后第21日分別測(cè)量豬的體重，計(jì)算相對(duì)日增重率，結(jié)果攻毒對(duì)照組在攻毒后出現(xiàn)增重緩慢的情況，與4個(gè)免疫攻毒組和空白對(duì)照組的相對(duì)日增重率差異顯著；4個(gè)免疫攻毒組與空白對(duì)照組的相對(duì)日增重率差異不顯著，結(jié)果見表1。

表1 相對(duì)日增重率測(cè)定結(jié)果

a和b字母不相同表示差異顯著(P<0.05)；a和b字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

The difference of shoulder mark letters means significant difference(P<0.05),The same of shoulder mark letters means no significant difference(P>0.05).

2.3 攻毒后PCV2 PCR測(cè)定結(jié)果 攻毒后21 d采血，用PCR方法檢測(cè)PCV2病毒核酸。疫苗A免疫組、疫苗B免疫組、疫苗D免疫組和空白對(duì)照組均未檢出PCV2病毒核酸；疫苗C免疫組有1頭豬檢出PCV2病毒核酸；攻毒對(duì)照組有4頭豬檢出PCV2病毒核酸。結(jié)果見表2。

表2 PCR法檢測(cè)病毒血癥結(jié)果

2.4 病理切片分析結(jié)果 攻毒后21 d撲殺所有試驗(yàn)豬，剖檢觀察主要臟器的病理變化，并取股骨溝淋巴結(jié)進(jìn)行病理切片分析。剖檢結(jié)果表明，各疫苗免疫組和空白對(duì)照組豬的主要臟器均未出現(xiàn)肉眼可見的病理變化，攻毒對(duì)照組有4/5的豬腹股溝淋巴結(jié)出現(xiàn)腫大、充血等肉眼可見的病理變化。對(duì)所取的股骨溝淋巴結(jié)，用甲醛固定后制作石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理變化，疫苗免疫組與空白對(duì)照組的病理切片中淋巴小節(jié)的淋巴細(xì)胞呈藍(lán)染，排列緊密，無壞死，攻毒對(duì)照組的病理切片中出現(xiàn)局部淋巴小結(jié)的淋巴細(xì)胞排列較為松散，出現(xiàn)彌漫性的淋巴細(xì)胞減少(圖1)。

A：疫苗A免疫豬；B：疫苗B免疫豬；C：疫苗C免疫豬；D：疫苗D免疫豬；E：空白對(duì)照豬；F：攻毒對(duì)照豬A Vaccine A group, B Vaccine B group, C Vaccine C group, D Vaccine D group, E Blank control group，F(xiàn) Challenge control group

2.5 PCV2血清抗體ELISA測(cè)定結(jié)果 免疫后每周采血，用間接ELISA測(cè)定PCV2抗體。不同佐劑制備的疫苗免疫豬后PCV2抗體產(chǎn)生的時(shí)間不同，疫苗A和疫苗D在免疫后7 d，即可檢測(cè)到ELISA抗體，疫苗B、疫苗C則在免疫后第2周可檢測(cè)到ELISA抗體，二免后，所有疫苗免疫組PCV2血清ELISA抗體水平明顯升高，結(jié)果見圖2所示。

圖2 免疫后不同時(shí)間PCV2血清ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和抗原表位是由ORF2表達(dá)所產(chǎn)生的Cap蛋白，目前，各研究機(jī)構(gòu)將其作為制備亞單位疫苗目標(biāo)抗原。在工業(yè)化生產(chǎn)Cap蛋白的工藝，存在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，而采用真核表達(dá)系統(tǒng)——昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)該蛋白時(shí)，可以對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，使表達(dá)的產(chǎn)物更接近天然蛋白，其優(yōu)越性遠(yuǎn)超過細(xì)菌表達(dá)體系。目前，國(guó)外多個(gè)公司已相繼研究開發(fā)成功PCV2滅活疫苗或Cap蛋白重組亞蛋白疫苗，可用于有效預(yù)防PCV2感染[15-16]。表達(dá)的PCV2 Cap蛋白分子量比較小，在沒有免疫佐劑的協(xié)同刺激下，免疫原性也較差，因此，常常在制備疫苗時(shí)選擇合適的佐劑來增強(qiáng)免疫效果。目前，制備此類疫苗的佐劑一般包括弗氏完全/不完全佐劑、鋁膠佐劑、水性佐劑、白油佐劑、脂質(zhì)體、細(xì)菌菌影(Bacterial ghosts，BGs)等[17]。因此，本研究為了選擇良好的佐劑進(jìn)行工業(yè)化Cap蛋白疫苗的制備，選擇鋁膠佐劑、白油佐劑、水性佐劑(GEL 01)等3種不同佐劑來制備PCV2亞單位滅活疫苗，同時(shí)，用PCV2強(qiáng)毒對(duì)這3種疫苗免疫的動(dòng)物，進(jìn)行免疫效果的評(píng)價(jià)。

疫苗免疫后，不同疫苗PCV2血清ELISA抗體產(chǎn)生的時(shí)間不同，水性佐劑制備的疫苗與商品化疫苗在免疫后7 d即可檢測(cè)到，白油佐劑制備的疫苗和鋁膠佐劑制備的疫苗在免疫后14 d才可檢測(cè)到；二免后所有疫苗的PCV2血清抗體效價(jià)均快速升高并達(dá)到較高的抗體水平，在攻毒前平均水平均在1∶800以上，其中水佐劑制備的疫苗與商品化疫苗抗體水平相當(dāng)，與另外兩種佐劑制備的疫苗差異較顯著。對(duì)于疫苗的免疫效果，本研究采用臨床癥狀、平均日增重、病毒血癥以及腹股溝淋巴結(jié)的病理切片分析等4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。疫苗免疫后，在通針性上僅有白油佐劑制備的疫苗表現(xiàn)較差、臨床癥狀上，也僅有鋁膠佐劑制備的疫苗在免疫后有1頭豬出現(xiàn)一過性的發(fā)熱現(xiàn)象；疫苗免疫攻毒后，不同佐劑制備的疫苗在本研究中所檢測(cè)的4項(xiàng)指標(biāo)上均與攻毒對(duì)照組所檢測(cè)的4項(xiàng)指標(biāo)上差異顯著，均與空白對(duì)照組所檢測(cè)的4項(xiàng)指標(biāo)上無顯著差異，表明用鋁膠佐劑、白油佐劑、水性佐劑制備的疫苗均能取得良好的免疫效果。考慮到3種佐劑在通針性、臨床表現(xiàn)以及攻毒結(jié)果，優(yōu)選水性佐劑作為將來工業(yè)化生產(chǎn)疫苗的佐劑，為PCV2亞單位疫苗商用佐劑的選擇提供了必要的數(shù)據(jù)支撐。