高效液相色譜-示差折光檢測法測定開塞露中甘油的含量

李苗，余陽濤，馮光

(1.武漢藥品醫療器械檢驗所，武漢 430075；2.湖北科技學院，咸寧 437100)

開塞露常用于治療便秘、術后尿潴留等。常見的開塞露有兩種制劑，一種是甘油制劑，另一種是甘露醇、硫酸鎂制劑。兩種制劑成分不同，但作用原理基本一樣，都是利用甘油或山梨醇高濃度的高滲作用，軟化大便，刺激腸壁，反射性引起排便反應，再加上其具有潤滑作用，能使大便容易排出。開塞露中甘油含量測定的方法主要有滴定法、近紅外光譜法[1-3]、紫外-可見分光光度法[4]，但上述方法操作較繁瑣，且專屬性較差。筆者在本實驗中建立了采用示差折光檢測器的高效液相色譜(HPLC)法測定開塞露中甘油的含量，方法準確、專屬、快速，適用于含甘油開塞露大通量樣品的質量控制，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀(配示差折光檢測器，美國安捷倫公司)；Mettler SX105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；Millipore simplicity超純水機(美國密理博公司)。

1.2試藥 甘油對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：190057-201301，含量：99.5%)，開塞露(市售樣品，規格：含甘油52.8%～58.3%，批號：160419，170403，160517)，氯化鈣二水合物(國藥集團，分析純，批號：20170214)，水為純水機制超純水(18.2 mΩ)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：鈣型陽離子交換柱[Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+(8%)，300 mm×7.8 mm]；流動相：0.1%氯化鈣二水合物溶液；流速：0.6 mL·min-1，柱溫：60 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：示差折光檢測器，溫度55 ℃。甘油色譜峰保留時間約17 min，理論板數按甘油峰計算不低于10 000。

2.2對照品溶液的制備 稱取甘油對照品適量，精密稱定，加純化水溶解并稀釋制成0.5 mg·mL-1溶液，作為對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 取開塞露3支，將內容物混勻，精密稱取1 g，置100 mL量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲備溶液，精密量取5 mL，置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，制成0.5 mg·mL-1溶液，作為供試品溶液。

2.4陰性空白溶液的制備 取不含甘油的空白輔料，同法制備陰性空白溶液。陰性空白溶液在甘油峰保留時間處未檢出其他色譜峰，說明空白輔料對實驗結果無干擾。色譜圖見圖1。

A.系統適用性溶液；B.陽性空白；C.對照品；D.樣品；1.甘油；2.丙二醇；3.二甘醇。

圖1 甘油含量測定HPLC圖

A.system suitability solution;B.positive blank solution;C.reference substance;D.sample;1.glycerol;2.propylene glycol;3.diglycol.

Fig.1HPLCchromatogramsofglycerol

2.5專屬性實驗 分別稱取甘油、丙二醇、二甘醇對照品適量，用純化水溶解并稀釋制成0.5 mg·mL-1溶液，作為系統適用性溶液。照“2.1”項下方法測定，甘油、丙二醇、二甘醇色譜峰可完全分離。色譜圖見圖1。

2.6強制降解實驗 取供試品儲備液5 mL各5份，分別置50 mL量瓶，①加0.1 mol·L-1鹽酸10 mL，放置30 min，0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液中和，水稀釋至刻度；②加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL，放置30 min，0.1 mol·L-1鹽酸中和，水稀釋至刻度；③加入10%過氧化氫溶液0.5 mL，放置30 min，水稀釋至刻度；④水浴加熱30 min，水稀釋至刻度；⑤254 nm波長下光照24 h，水稀釋至刻度。對5份溶液進行測定，降解產物與甘油分離度均符合要求。見圖2。

2.7線性關系考察 稱取對照品適量，精密稱定，用純化水溶解并稀釋制成甘油含量0.03，0.08，0.3，1.6，2.8 mg·mL-1系列對照品溶液，分別精密進樣20 μL，以甘油濃度(X)對相應峰面積(Y)進行回歸，結果甘油回歸方程為：Y= 2.37×106X+7.80×104，r=0.999 0。甘油在0.03～2.8 mg·mL-1范圍內，濃度與峰面積之間具有較好的線性關系。

2.8精密度實驗 取對照品溶液，連續進樣6次，以甘油峰面積計算得RSD為0.3%，結果表明儀器精密度良好。

2.9定量限 取“2.2”項下對照品溶液，逐步稀釋，進樣測定。當信噪比(S/N)為10時，甘油定量限為4.4 μg·mL-1。

2.10重復性實驗 取同一批樣品，按“2.3”項制備供試品溶液6份，依法測定，采用外標法以峰面積計算供試品中甘油含量，結果平均含量55.32%，RSD為1.6%。說明該方法重復性良好。

A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.熱破壞；E.光破壞；1.甘油；2.丙醇。

A.acid destruction; B.alkali destruction; C.oxidation destruction; D.thermal destruction; E.light destruction；1.glycerol；2.propylene glycol.

Fig.2HPLCchromatogramsofcompulsorydestructiontests

2.11穩定性實驗 精密量取供試品溶液20 μL，在2，4，8 h分別進樣測定，甘油峰面積RSD為0.7%，結果表明供試品溶液8 h內穩定。

2.12加樣回收率實驗 取本品0.4 g，精密稱定，置100 mL量瓶，分別精密加入甘油對照品適量，純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶，水稀釋制成高、中、低濃度甘油溶液各3份，分別進樣20 μL，外標法以峰面積計算回收率。結果甘油平均回收率99.37%，RSD為1.4%，見表1，表明該方法回收率良好。

表1 甘油加樣回收率實驗結果

Table.1Recoverytestofglyceroln=9

樣品取樣量甘油加入量甘油測得量g回收率/%0.389 30.258 90.474 998.520.439 30.269 30.512 698.200.388 20.274 40.493 499.910.423 20.326 10.566 6100.440.387 50.335 80.560 2101.640.436 50.354 60.593 297.770.380 00.403 00.618 7100.260.449 20.416 70.663 998.440.409 60.387 00.615 399.22

2.13樣品測定 精密量取供試品溶液及對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算甘油含量，結果見表2。經t檢驗，兩種方法測定結果差異無統計學意義。

表2 3批樣品中甘油含量測定結果

Table.2Resultsofthedeterminationonthreebatchesofsamples%

批號HPLC法含量滴定法含量16041956.556.917040355.755.216051756.755.8

3 討論

3.1色譜柱選擇 筆者在本實驗中以專屬性強的鈣型陽離子交換柱為色譜柱，可將甘油與結構類似物丙二醇、二甘醇等完全分離，故最終選擇鈣型陽離子交換柱為本實驗的色譜柱。

3.2檢測器選擇 筆者在本實驗采用示差折光檢測器進行甘油的檢測。由于甘油基本無紫外吸收，不適合常規紫外檢測器測定；示差折光檢測器為通用型檢測器，可以對甘油進行有效檢測，故選擇示差檢測器為本實驗色譜系統的檢測器。

3.3流動相選擇 筆者在本實驗中分別考察不同濃度氯化鈣溶液對分離效果的影響。結果表明，氯化鈣溶液濃度越高，甘油保留時間越長，與其他色譜峰分離度越大。綜合考慮分離度與保留時間，筆者在本實驗中采用0.1%氯化鈣溶液作為流動相。

3.4結果 現行國家標準采用容量法測定開塞露中甘油含量，而現有文獻報道方法主要有電位滴定法、分光光度法、近紅外光譜法等[5-7]。筆者在本實驗中采用HPLC法測定開塞露中甘油含量，專屬性強，操作簡便，重復性好。可用于開塞露中甘油含量的大通量檢測，還可以在藥品安全監管工作中進行藥品中可能存在非法添加二甘醇情況的風險篩查，避免二甘醇非法替代甘油使用導致的藥害事件發生。