清胰顆粒制備工藝優選與含量測定*

歐水平，鄭小翠，陳靈，王森，3，任麗，蔡迎迎

(1.遵義醫科大學附屬醫院藥劑科，遵義 563000；2.遵義醫科大學藥學院，遵義 563003；3.貴州省畢節市第一人民醫院藥學實驗室，畢節 551700)

清胰湯為遵義醫科大學附屬醫院協定處方，現已記載于《古今名方》，該方由大黃、赤芍、木香、丹皮、厚樸、梔子、延胡索、芒硝組成，具有疏肝利膽、清熱瀉火、止痛通便功效。臨床及實驗研究表明[1-3]，清胰湯對急性胰腺炎有較好治療作用，具有抑制胰酶活性、降低血清淀粉酶、清除腸道內毒素、防止腸道菌群移位等作用，可防止過氧化損傷，還可抑制炎癥因子釋放，阻斷炎癥連鎖反應，減少胰腺損傷及并發癥發生等。臨床長期以煎劑給藥，顆粒劑是在煎劑基礎上進一步濃縮、精制而得，既保持了煎劑吸收快、作用迅速的優點，又克服了煎劑易霉變，攜帶、貯存不便等缺點。本實驗在清胰湯提取工藝研究基礎上[4]，將傳統煎劑制成顆粒劑(清胰顆粒)，以顆粒劑成型率、溶化率、含水量、休止角為綜合評價指標，結合單因素實驗與PB(Plackett-Burman)實驗設計，優選清胰浸膏粉與填充劑的配比、乙醇濃度、黏合劑濃度與用量、制粒篩目、干燥溫度。清胰顆粒成分復雜，大黃瀉下攻積、利濕退黃為君藥，故建立高效液相色譜(HPLC)法對清胰顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量進行測定，以期為清胰顆粒的生產及質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent-1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，包括四元泵、DAD 檢測器、柱溫箱、自動進樣器)，RE-2000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，DZF-250真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)，ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.1 mg)，800Y型多功能不銹鋼粉碎機(永康市鉑毆五金制品有限公司)，BT-1000粉體綜合特性測試儀(丹東百特儀器有限公司)。

1.2試藥 大黃素、大黃酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110756-201512，110757-201607)，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17030605，MUST-17030603，MUST-17030622)，清胰浸膏粉(自制)，乳糖(上海華茂藥業有限公司)，微晶纖維素101、糊精和可溶性淀粉、聚維酮K30(PVP-K30)、聚乙二醇6000 (PEG6000)、羥丙甲纖維素(HPMC 300 mPa·s)均購于安徽山河藥用輔料股份有限公司，高黏度甲基纖維素(15 000 mPa·s)購于生工生物工程上海(股份)有限公司，乙醇(成都科龍化工試劑廠)，水為純化水。

2 方法與結果

2.1清胰顆粒的制備 稱取處方量各藥材飲片，加入10倍量65 ℃ 水浸泡30 min(除芒硝外)，煎煮3次，每次20 min，濾過，合并3次濾液[4]，將芒硝溶解于濾液中，55 ℃減壓濃縮至稠浸膏，70 ℃減壓干燥，干浸膏粉碎過80目篩(篩孔內徑：180 μm)，即得清胰浸膏粉。稱取浸膏粉與輔料，按一定比列混勻，加入一定量黏合劑，制得適宜軟材，擠壓過篩制粒，干燥0.5 h，過一號與四號篩(篩孔內徑分別是2000與250 μm)整粒即得。

2.2顆粒評價指標的測定

2.2.1成型率測定 將制得的清胰顆粒稱定質量(M)，分別過一號與四號篩，收集能過一號篩但不能過四號篩的顆粒，稱質量記為(m)，成型率(%)=m/M×100%。

2.2.2溶化率測定 在干燥至恒重的離心管中加入精密稱定合格清胰顆粒0.5 g，加入熱水10 mL，攪拌振蕩 5 min，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑r=10 cm)，棄去上清液，殘渣80 ℃ 烘干至恒定質量，稱定質量，平行實驗3份，計算平均值，溶化率(%)=(總顆粒質量-殘渣質量)/總顆粒質量×100%[5]。

2.2.3含水量測定 按照《中華人民共和國藥典》2015年版通則水分測定法第二法(烘干法)[6]測定。

2.2.4休止角測定 取清胰顆粒，采用固定漏斗法，使用BT-1000型粉體綜合特性測試儀，分別從3面測量圓錐體斜面與平面的夾角，取平均值即得休止角。

2.2.5吸濕率的測定 配制氯化鈉(NaCl)過飽和溶液，置干燥器中，25 ℃恒溫飽和24 h。稱量瓶開蓋，置于其中飽和24 h，精密稱定質量M1，取清胰顆粒適量，平鋪于稱量瓶內，精密稱定質量M2，放入干燥器，24 h時取出精密稱定質量M24。吸濕率(%)=(M24-M2)/(M2-M1) ×100%[7]。

2.3處方篩選

2.3.1浸膏粉與填充劑配比的確定 分別將糊精與清胰浸膏粉按0.2：1，0.5：1，1：1制粒，比例為0.5：1制得顆粒成型率、溶化性較好，且清胰湯日服生藥量為133 g[8]，清胰干浸膏得率約30%，考慮顆粒服用量，所以糊精與浸膏粉最大配比為0.5：1。

2.3.2填充劑的篩選 以顆粒成型率、吸濕率(24 h)、含水量、溶化性及制粒情況為考察指標，分別以乳糖、糊精、可溶性淀粉和微晶纖維素為填充劑，按填充劑與浸膏粉比為0.5：1，加入適量5.0%PVP-K30(90%乙醇為溶劑)，制粒。結果綜合吸濕性、成型率、水分及制粒過程，糊精較其他3種輔料更好，故選取糊精作為輔料。

2.3.3黏合劑及濃度的確定 以90%乙醇為溶劑，分別考察濃度均為1.0%的PEG6000、PVP-K30、HPMC、高黏度甲基纖維素為黏合劑，以成型率、溶化性為評價指標，發現以PEG6000黏合劑制得顆粒成型率較高，能溶解成均勻混懸液，其他黏合劑均有不同程度白色沉淀。選擇1.0%，1.3%，1.4%，1.5%，1.7%，1.8% PEG6000(90%乙醇為溶劑)為黏合劑制粒，發現所有制得顆粒均能溶解成均勻混懸液，隨PEG6000濃度增加，軟材黏性增強，PEG6000濃度在1.3%，1.4%，1.5%制得軟材適中，過篩容易，成型率>80%。

2.3.4顆粒處方及工藝優化 根據單因素實驗考察結果，考慮各因素相互影響，綜合考察輔藥比、乙醇體積分數、PEG6000濃度及用量、制粒篩目、干燥溫度對顆粒成型率、溶化率、含水量、休止角的影響，設計因素水平見表 1。采用JMP 13.0版軟件中PB設計安排實驗，按“2.2”項方法對制得顆粒進行評價，結果見表2。

表1 因素與水平

采用 JMP 軟件對處方及結果成型率、含水量、溶化率、休止角進行高斯過程模型擬合。成型率擬合結果表明，黏合劑用量為主效應，占0.736，主效應是模型中的函數效應與每個因子的總變異之比，各因素間交互作用對其無影響；成型率與黏合劑用量呈正相關，與干燥溫度呈負相關；輔料比例對溶化率影響較大，為主效應項，占0.999，隨輔料比例增大成型率增加，溶化率減小，這與糊精溶化性相符；黏合劑用量對休止角影響較大，其次是乙醇濃度，乙醇濃度或輔藥比例升高，黏合劑用量越多，休止角越小，顆粒流動性越好；含水量受影響因素較多，依次分別為黏合劑用量、乙醇濃度、輔料比例與干燥溫度，黏合劑用量越多、輔料越少、乙醇濃度和溫度越低，含水量越高。實驗設計范圍內PEG濃度和制粒篩孔大小對各指標影響小，乙醇濃度及黏合劑的用量對各指標影響較大。曲面圖見圖1。

以成型率、溶化率最大化，休止角、含水量最小化為優化意愿，采用JMP軟件預測刻畫器進行預測進行優化，結果見圖2。最優處方與成型工藝為：糊精與清胰浸膏粉比例為0.5：1，1.0%PEG6000的95%乙醇溶液，用量為25%，過16目篩(篩孔內徑：1 190 μm)制粒，65 ℃干燥0.5 h；制得顆粒的成型率、溶化率、休止角和含水量分別為97.09%，71.23%，23.96°，6.84%，預測意愿為0.86。

2.3.5處方及工藝驗證 按優化最佳工藝條件制備清胰顆粒3批，成型率、溶化率、含水量、休止角、吸濕率分別為(94.83±0.47)%，(75.15±0.44)%，(5.96±0.15)%，(22.55 °±0.22 °)，(12.78±0.33)%。可見制得顆粒成型性、流動性良好，各項指標也符合《中華人民共和國藥典》2015年版要求，表明優選的處方及工藝參數穩定、可靠。

2.4顆粒臨界相對濕度的測定 分別配制氯化鎂、碳酸鉀、溴化鈉、碘化鉀、氯化鈉、氯化鉀和硝酸鉀7種過飽和鹽溶液，按“2.2.5”項方法，放置8 d，測定不同時間清胰顆粒的吸濕率，以達吸濕平衡，以吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標，圖中曲線兩端做切線，兩切線交點對應的橫坐標即為臨界相對濕度。結果表明清胰顆粒的相對濕度為72.78%，即在生產、貯存環境濕度應控制在72.78%內，以減少濕度對清胰顆粒質量的影響。

2.5清胰顆粒中蒽醌類成分含量測定

2.5.1色譜條件 UItimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，洗脫程序：0～13 min，15%→28%A；>13～15 min，28%→47%A；>15～55 min，47%→56%A；>55～60 min，56%→80%A；>60～65 min，80%→80%A；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1，檢測波長：237 nm，進樣量10 μL。

表2 實驗設計與結果

圖1 響應曲面

圖2 各項評價指標預測刻畫器

2.5.2溶液配制 單個對照品溶液的制備：精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品2 mg，分別置于10 mL量瓶，適量三氯甲烷溶解后加甲醇定容，即得 200 μg·mL-1單個對照品溶液。

供試品的溶液制備：精密稱定清胰顆粒1 g于50 mL量瓶，加水稀釋至刻度，混勻后準確吸取5 mL，加入10%鹽酸5 mL水解30 min后，乙醚萃取至無色，低溫揮發去乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至 5 mL，孔徑0.22 μm濾膜濾過即得。取空白顆粒(不含清胰浸膏粉，由單純的輔料組成)同法制備。

2.5.3專屬性考察 分別取空白溶劑、空白顆粒、混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.5.1”項色譜條件進樣測定，得色譜圖，見圖3，溶劑和輔料對蒽醌類成分測定無干擾，各成分分離度良好，此方法專屬性良好。

2.5.4線性關系考察 分別取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各1 mL和大黃素甲醚單個對照品溶液0.8 mL，置同一5 mL量瓶，加甲醇定容制得每毫升含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚40 μg和大黃素甲醚32 μg的混合對照品溶液。逐級稀釋2倍得系列濃度混合對照品溶液。按“2.5.1”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程為：蘆薈大黃素Y=25.382X+6.445 8(r=0.999 9)、大黃酸Y= 37.384X+25.5(r=0.999 7)、大黃素Y=25.732X+14.542(r=0.999 7)、大黃酚Y=25.405X+9.970 8(r=0.999 4)、 大黃素甲醚Y=13.082X-5.770 8(r=0.999 2)，表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚均在2.5～40.0 μg·mL-1、大黃素甲醚在2.0～32.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

A.空白溶劑；B.空白顆粒；C.混合對照品；D.清胰顆粒；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。

圖3 清胰顆粒HPLC圖

A.blank solvent；B.blank granule；C.mixed reference substance；D.Qingyigranule；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion.

Fig.3HPLCchromatogramsofQingyigranule

2.5.5精密度實驗 取同一供試品溶液，在色譜條件下連續進樣6次，記錄峰面積，計算含量，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為1.68%，0.48%，2.28%，1.49%，0.66%，表明儀器精密度良好。

2.5.6重復性實驗 取同一批號清胰顆粒6份，按 “2.5.2”項方法平行制備供試品溶液，進樣測定，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為1.76%，1.02%，1.58%，1.97%，1.31%，表明該方法重復性良好。

2.5.7穩定性實驗 取同一供試品溶液，室溫下分別于0，2，4，8，15，24 h進行測定，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為1.45%，1.36%，1.27%，2.62%，2.62%，表明供試品溶液室溫條件下24 h內穩定。

2.5.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的清胰顆粒9份，分別加入相當于樣品含量50%，100%，150%對照品各 3 份，按“2.5.2”項方法制備供試品溶液，進樣測定，計算平均回收率，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回收率分別為100.42%、97.82%、97.54%、98.03%、99.95%，RSD分別為2.55%、1.73%、1.49%、2.15%、1.47%。

2.5.9樣品的含量測定 取清胰顆粒3批，按供試品溶液制備和測定方法，對樣品進行制備和含量測定，計算各有效成分含量，結果見表3。

表3 清胰顆粒中5種有效成分的含量

Table.3ContentsoffiveactivecomponentsinQingyiparticlesmg·g-1

有效成分測量次數123平均含量RSD/%蘆薈大黃素0.550.550.550.550.80大黃酸0.910.930.940.931.42大黃素0.640.650.650.650.61大黃酚0.690.720.710.711.70大黃素甲醚0.460.470.460.461.02

3 討論

對于急性胰腺炎，腸內營養治療可緩解患者炎癥反應，抑制腸道菌群移位，改善癥狀，提升治療效果[9-11]。麥芽糖糊精多作為腸內營養制劑成分[12]。由于急性胰腺炎患者胰島內分泌功能可能受破壞，為防止葡萄糖迅速釋放和吸收，減少對胰島素的依賴，因此選擇糊精作為填充劑，將清胰顆粒制備成無糖顆粒。

芒硝與清胰浸膏粉有較強吸濕性，難制粒，需加入輔料以降低吸濕性。乳糖抗吸濕性強，黏性弱，流動性好，制得顆粒細粉多，成型率低。急性胰腺炎患者胰島可能受損，胰島素分泌降低，用乳糖作為填充劑增加胰腺負擔。微晶纖維素也具有較好抗吸濕性，由于本身不溶于水，使得顆粒溶化性較差。因而選擇綜合較好的糊精作為填充劑。吸濕性：芒硝>清胰浸膏粉>填充劑，三者混合順序直接影響混合后物料的吸濕性，進而影響顆粒制粒難易程度及成型率。將芒硝溶于清胰提取液，然后濃縮干燥，得到浸膏粉，將其再與輔料混合，制得軟材適中，顆粒外觀均勻。

制備顆粒劑時，乙醇濃度的選擇也較重要。乙醇濃度較低，在混合、制粒時較易結塊，難過篩，若乙醇濃度越高，其揮發越快，使得所制顆粒易碎而不易成型。故本實驗選用95%乙醇為溶劑制備黏合劑，以達到降低吸濕性、增加黏性的效果，從而提高成型率。由于乙醇濃度較高，加入后攪拌時間過長會導致黏合劑中乙醇揮發，剩下的水引濕性太強，導致軟材濕黏發硬結塊不易制粒。高濃度乙醇制粒后縮短干燥時間，避免長時間干燥造成藥效成分損失。

清胰顆粒成分復雜，大黃是清胰湯的君藥，也是治療急性胰腺炎的公認藥物[13]，大黃主要有效成分是蒽醌類物質，后者具有較好抗炎作用[14]。因此，筆者在本實驗采用HPLC法，對優化工藝條件下制得的清胰顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚進行含量測定，為清胰顆粒的生產及質量控制提供參考。