余苣降酸茶質量標準研究*

鄭江萍，張志權，吉慧敏，黃良永

(1.湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院藥學部，十堰 442000；2.湖北醫藥學院藥學院，十堰 442000)

余苣降酸茶是我院根據傳統經驗方研制的中藥袋泡茶，具有利尿消腫、清熱涼血、通經活絡、疏散風熱之功效，主要用于高尿酸血癥所致痛風、痛風性關節炎及無癥狀型高尿酸血癥。余苣降酸茶處方由余甘子、菊苣、粉葛、桑葉、淡竹葉5味中藥組成，處方中余甘子為君藥，具有清熱涼血、消食健胃、生津止渴功效；菊苣和粉葛為臣藥，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫和解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡、解酒毒之功效；桑葉和淡竹葉為輔助藥物，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目和清熱瀉火、除煩止渴、利尿通淋之功效[1]。該制劑為新開發制劑，為控制該制劑質量，筆者參考文獻[2-7]，依據《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中茶劑質量標準要求，對該茶劑性狀、水分、裝量差異、微生物限度進行常規檢查，對桑葉和淡竹葉進行薄層色譜(TLC)鑒別，對余甘子和粉葛藥材的指標成分沒食子酸和葛根素采用高效液相色譜(HPLC)法進行定性和定量測定，并對其制備工藝進行考察。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DIAON U3000高效液相色譜儀(美國戴安公司，四元梯度泵、自動進樣器、多波長紫外檢測器、柱溫箱)；Chromeleon色譜工作站；Waters SunFire C18色譜柱(美國WATERS公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；KM3400超聲波提取儀(廣東科盟儀器廠，可調功率)；AUW120D電子分析天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)；FA-2004電子分析天平(上海精密儀器，感量：0.1 mg)；MAC50/1/NH紅外水分測定儀(歐盟波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne)。

1.2試藥 沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204，含量：89.9%)；葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201313，含量：100%)；余甘子、菊苣藥材由湖北清大藥業科技有限公司提供(批號：170301)；粉葛、桑葉、淡竹葉由湖北神農本草中藥飲片有限公司提供(批號分別為：20170907，2180301，20170801)，藥材由湖北醫藥學院藥學院中藥教研室葉方副教授鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部規定；余苣降酸茶(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院制劑室生產，規格：每袋5 g，批號：20180521，20180718，20180922)；乙腈(美國TEDIA公司，色譜純)；水為超純水；甲醇、三氯甲烷、石油醚、甲苯、乙酸乙酯、甲酸均為分析純；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司，批號：20170917)。

2 方法與結果

2.1處方 余甘子、菊苣、粉葛、桑葉、淡竹葉各200 g。

2.2制備 將處方藥材以水快速搶洗，流通蒸汽滅菌30 min，混干，粉碎成粗粉，過篩，混勻，分裝成每袋5 g。

2.3質量標準研究

2.3.1性狀和檢查 性狀：本品為灰棕色粉末，味微苦；水分檢查[1]：依據《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則水分測定操作方法測定，≤12.0%。測得結果均符合規定，數據見表1。

微生物限度檢查[1]：依據《中華人民共和國藥典》2015年版通則四部“微生物限度”檢查法檢查，需氧菌總數≤10-4cfu·g-1，真菌和酵母菌數≤10-2cfu·g-1，不得檢出大腸埃希菌(1 g)，不得檢出沙門氏菌(10 g)，耐膽鹽革蘭陰性菌應<102cfu·g-1。測定結果均無菌生長。

2.3.2鑒別 桑葉的TLC鑒別[1]：取本品粉末5 g，加石油醚(60～90 ℃)30 mL，加熱回流30 min，棄去石油醚液，藥渣揮干石油醚，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加熱水10 mL，60 ℃攪拌使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含桑葉的處方量其他藥材，按制備工藝制備缺桑葉的陰性樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。另取桑葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5：2 ：1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈(波長365 nm)檢視，3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，無相同顏色斑點。

淡竹葉的TLC鑒別[8]：取本品粉末2.5 g，加純化水50 mL，加熱煮30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加三氯甲烷60 mL，超聲30 min，濾過，濾液水浴濃縮至1 mL，作為供試品溶液；取不含淡竹葉的處方量其他藥材，按制備工藝制備陰性樣品，并按上述供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。另取淡竹葉對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(19：1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(波長254 nm)下檢視，3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色熒光斑點；陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，無相同顏色的斑點。見圖1。

表1 余苣降酸茶水分測定結果

Table.1DeterminationresultsofwatercontentinYujujiangsuantea%

批號第1次第2次平均值201805214.024.064.04201807183.893.853.87201809224.134.114.12

裝量差異[1]：依據《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則“裝量差異檢查法”操作方法測定。測得結果均符合規定，數據見表2。

余甘子和粉葛的鑒別：在含量測定項下，3批供試品溶液色譜圖中沒食子酸和葛根素色譜峰的保留時間和對照品溶液色譜圖中的保留時間一致；而且缺余甘子的陰性樣品溶液色譜圖中無相應沒食子酸色譜峰，缺粉葛的陰性樣品溶液色譜圖中無相應的葛根素色譜峰。

表2 余苣降酸茶裝量檢查結果

Table.2InspectionresultofthequantityofYujujiangsuanteag

批號12345678910平均裝量201805215.004.995.024.984.965.005.015.105.054.985.01201807184.985.025.125.104.995.115.064.955.075.195.06201809225.034.894.925.105.095.184.955.205.135.085.06

2.3.3余甘子和粉葛的含量測定 色譜條件：Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：0.2%磷酸溶液，流動相B：乙腈，按表3進行梯度洗脫；檢測波長273 nm；柱溫30 ℃；流速1.00 mL·min-1。

圖1 薄層色譜圖(1.供試品，批號：20180521；2.對照藥材；3.陰性樣品)

Fig.1TLC(1.sample：20180521;2.medicinalmaterialsreference;3.negativesample)

對照品儲備液的制備：精密稱取沒食子酸對照品(89.9%)101.4 mg置于50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得1.823 2 mg·mL-1沒食子酸對照品儲備液；精密稱取葛根素對照品31.38 mg，置于50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.627 6 mg·mL-1葛根素對照品儲備液。分別精密量取沒食子酸和葛根素對照品儲備液2.5 mL，置于同一20 mL量瓶，用甲醛稀釋至刻度，混勻，即得對照品混合溶液。

表3 梯度洗脫表

供試品溶液的制備：精密稱定余苣降酸茶粉末5 g，加70%甲醇50 mL，稱定質量，回流30 min，放置至室溫后，用甲醇補充丟失質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置25 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，濾過，取續濾液即得供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：按原處方量和工藝制備缺余甘子的降酸茶，按“供試品溶液的制備”方法制備陰性對照溶液Ⅰ(缺余甘子)。按原處方量和工藝制備缺粉葛的降酸茶，按“供試品溶液的制備”方法制備陰性對照溶液Ⅱ(缺粉葛)。

色譜系統適用性實驗：取對照品混合溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀。在規定色譜條件下，供試品溶液在與對照品色譜相應的位置有沒食子酸峰和葛根素峰，二成分峰與其相鄰峰完全分離，理論板數以葛根素峰計均>4 000；且陰性對照溶液Ⅰ中無相應沒食子酸峰，陰性對照溶液Ⅱ中無相應葛根素峰；其他成分對測定無干擾，見圖2。

標準曲線的繪制：分別精密量取沒食子酸對照品儲備液和葛根素對照品儲備液各10.0，5.0，2.5，1.0，0.5 mL置于同一20 mL量瓶，混合均勻，用甲醇定量稀釋成含沒食子酸911.6，455.8，227.9，91.2，45.58 μg·mL-1，含葛根素313.8，156.9，78.45，31.38，15.69 μg·mL-1系列混合對照品溶液，精密量取5 μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標，經線性回歸，得標準曲線方程：Y沒食子酸=0.003 7X沒食子酸+0.016 7，R2=0.999 3，線性范圍45.58～911.6 μg·mL-1；Y葛根素=0.005 6X葛根素+0.005 2，R2=0.999 3，線性范圍15.69～313.8 μg·mL-1。在線性范圍內，二者進樣濃度與峰面積呈良好的線性關系。

A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液Ⅰ；D.陰性對照溶液Ⅱ；1.沒食子酸；2.葛根素

精密度實驗：取混合對照品溶液5 μL，在規定色譜條件下，連續平行進樣6次，記錄沒食子酸和葛根素的峰面積，計算6個峰面積值RSD值，沒食子酸、葛根素峰面積RSD分別為1.575%、0.179%，表明分析方法精密度良好。

重復性實驗：取同一批(批號：20180521)樣品，按規定供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液6份，分別取5 μL進樣，記錄兩種成分峰面積，并計算峰面積RSD值。結果沒食子酸峰面積平均值為111.279 2，RSD為0.98%；葛根素峰面積平均值21.542 6，RSD為1.16%，表明測定方法重復性好。

穩定性實驗：取同一批(批號：20180521)樣品，按照規定供試品溶液制備方法制成供試品溶液，在室溫下放置1，6，12，24 h，分別測定色譜峰面積，計算得沒食子酸和葛根素峰面積RSD分別為0.55%，0.67%，表明樣品在24 h內穩定。

回收率實驗：精密稱取同一批(批號：20180718)樣品0.5 g，共6份，分別精密加入沒食子酸對照品5.5 mg、葛根素對照品2.0 mg，加入70%甲醇溶液10 mL，按照規定供試品溶液的制備方法，制備樣品并測定沒食子酸和葛根素的峰面積，用外標一點法計算含量和回收率。結果見表4。

樣品含量測定：取3批樣品，按規定供試品溶液制備方法制成樣品溶液，在規定色譜條件下，分別取對照品混合溶液(含沒食子酸455.8 μg·mL-1、葛根素156.9 μg·mL-1)和樣品溶液5 μL，進樣，測定兩種成分峰面積，以外標一點法計算沒食子酸、葛根素含量。結果見表5。

3 討論

在篩選色譜條件時，流動相采用0.2%磷酸溶液-乙腈(95：5)等度洗脫，沒食子酸、葛根素與相鄰雜質分離不理想；采用梯度洗脫，流動相極性由強到弱(乙腈比例由5%增大到70%)，使2種成分與相鄰色譜峰完全分離，取得較為理想的結果。沒食子酸的最大吸收波長為273 nm，葛根素的最大吸收波長為254 nm。本實驗分別對254和273 nm進行測定，結果顯示273 nm波長可兼顧2種被測成分的最大靈敏度，故采用273 nm作為檢測波長。

表4 沒食子酸和葛根素加樣回收實驗結果

Table.4Experimentalresultsofrecoverytestongallicacidandpuerarin

成分取樣量/g樣品量加入量測得量mg加樣回收率平均回收率RSD%沒食子酸0.650 95.165.5410.4695.670.652 25.175.5710.6197.670.649 55.155.5610.5396.760.643 55.105.5910.95104.650.649 85.155.6211.00104.090.653 85.185.5610.96103.96100.474.16葛根素0.650 92.041.883.8194.150.652 22.041.853.7994.590.649 52.041.923.8091.670.643 52.022.164.21101.390.649 82.042.104.0997.620.653 82.052.023.9393.0795.413.70

表5 沒食子酸和葛根素含量測定結果

Table.5Contentdeterminationofgallicacidandpuerarinn=3，mg·g-1

樣品批號沒食子酸葛根素20180521 含量8.093.04 RSD/%1.471.9020180718 含量7.933.14 RSD/%0.940.4920180922 含量7.793.29 RSD/%0.530.18

在樣品溶液制備時，分別采用50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、100%水作為提取溶媒，采用超聲和回流提取方法，采用0.5，1，1.5 h不同提取時間，進行單因素優化，比較提取效果，結果表明70%甲醇回流0.5 h提取效果最好。

根據3批樣品含量測定結果，以沒食子酸和葛根素含量平均值的80%作為最低含量限度來控制成品中2組分的含量，即每克樣品中沒食子酸、葛根素含量分別不得低于6.36和5.53 mg。