超高效液相色譜法分析不同產區青翹主成分含量*

張曉燕，謝勇，祝宇，余世榮，王嬌莉，杜鵬陽

[1.湖北省十堰市人民醫院(湖北醫藥學院附屬人民醫院)藥學部，十堰 442000；2.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，十堰 442000；3.兵兵宏康中藥飲片(十堰)有限公司，十堰 442000]

青翹是木犀科連翹屬連翹[forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl]的果實，在秋季初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干的藥材[1-2]。青翹藥材以野生為主，主產于陜西、山東、安徽、河北、山西、河南、湖北等地[3]。但長期以來各產區野生青翹一直處于自由采收，采青、搶青現象突出，缺乏有效管控的狀態，導致不同產地青翹外觀性狀及有效成分含量等方面存在差異，各產區藥材質量良莠不齊。青翹主要含有連翹酯苷A、連翹酯苷B、連翹苷、連翹酯素、蘆丁、右旋松脂酚等化學成分[4]，是發揮抗菌、抗炎、解熱、鎮吐、鎮痛、抗病毒、抗氧化生理活性的物質基礎。筆者在本實驗參考王姝君等[5-8]連翹活性成分含量測定方法，采用超高效液相色譜(UPLC)法建立青翹中連翹苷、連翹酯苷A 及蘆丁一測多評含量測定方法，采用層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)對3種成分權重進行積分，綜合評價不同產地青翹質量差異。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity 超高效液相色譜儀(美國Waters 公司，包含四元泵、柱溫箱、自動進樣器、PDA 檢測器、Empower 工作站) ；電子分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；H1650-W微量臺式高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；2013QT超聲儀(超聲波清洗機)、藥篩等。

1.2藥物與試劑 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq18012210、wkq16060102、wkq18012501，含量均為98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為雙重蒸餾水；其他試劑均為分析純。18批青翹藥材采自山西、陜西、河南、湖北等地，經湖北中醫藥大學陳科力教授鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1色譜條件 ACQUITYULCRBEH C18色譜柱 ( 2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相乙腈 (A)-0.2% 甲酸溶液 (B)，梯度洗脫 ( 0～15 min，10%→30%A)；檢測波長277，330 nm；流量0.3 mL·min-1；柱溫 35 ℃；進樣量 1 μL。色譜圖見圖 1。

2.2對照品溶液的制備 取連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.28，0.21，0.21 mg·mL-1溶液，搖勻，低溫、避光儲存備用。

2.3供試品溶液的制備 取本品粉末[過三號篩，50目，篩孔內徑：(180±7.6) μm)]約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入70%甲醇15 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4線性關系考察 精密吸取“2.2”項各對照品溶液，制成連翹苷濃度為93 μg·mL-1、連翹酯苷A濃度為70 μg·mL-1、蘆丁濃度為70 μg·mL-1的混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μL，測定各峰面積。以進樣量(μL)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，得回歸方程，見表1，連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁在表1中測定范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗 取混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算得連翹苷色譜峰RSD=1.58%(n=6)，連翹酯苷A色譜峰RSD=1.87%(n=6)，蘆丁色譜峰RSD=1.74%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.6重復性實驗 取6份同一樣品各約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項制備方法制備供試品，按“2.1”項色譜條件進樣，記錄色譜峰面積并計算RSD值。結果得連翹苷RSD=1.56%(n=6)，連翹酯苷A RSD=0.92%(n=6)，蘆丁RSD=2.48%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.7穩定性實驗 取同一供試品，按“2.3”項色譜條件分別于0，1，2，4，6，8，12 h進樣，記錄峰面積并計算RSD值，結果得連翹苷RSD=2.18%(n=6)，連翹酯苷A RSD=0.87%(n=6)，蘆丁RSD=0.80%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8加樣回收率實驗 取已知含量連翹粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，置15 mL錐形瓶，分別精密加入連翹苷對照品3.650 mg，連翹酯苷A19.500 mg，蘆丁對照品2.680 mg，再加70%乙醇定容，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣1 μL。計算加樣回收率。結果見表2。

A.連翹苷對照品；B.連翹酯苷A對照品；C.蘆丁對照品；D.青翹樣品；1.連翹苷；2.連翹酯苷A；3.蘆丁。

A.phillyrin control；B.forsythiaside A control；C.rutin control；D.sample of green fructus forsythiae；1.phillyrin；2.forsythiaside A；3.rutin.

Fig.1UPLCchromatogramsofgreenfructusforsythiae

表1 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁回歸方程

Table.1Linearrelationshipofphillyrin,forsythiasideAandrutin

測定成分回歸方程R線性范圍/μg連翹苷Y=207 543X-521.961.000 00.009 3～0.297 6連翹酯苷AY=429 304X-1611.21.000 00.007 0～0.224 0蘆丁Y=298 262X-3089.40.999 90.007 0～0.224 0

表2 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁加樣回收率

Table.2Recoveryofphillyrin，forsythiasideAandrutin

測定成分取樣量樣品量加入量測得量mg回收率RSD%連翹苷260.503.6573.6507.19796.986254.753.6463.6507.28699.726256.503.6713.6507.23197.534256.253.6673.6507.27198.740254.003.6353.6507.26899.534257.503.6503.6507.29599.8631.23連翹酯苷A260.5019.55219.50038.92599.349254.7519.49419.50038.87499.385256.5019.62819.50038.90898.872256.2519.60919.50038.96699.267254.0019.43719.50038.90199.815257.5019.51319.50038.96399.7440.35蘆丁260.502.6862.6805.26396.157254.752.6782.6805.32898.881256.502.6962.6805.26495.821256.252.6942.6805.24795.261254.002.6702.6805.29998.097257.502.6812.6805.34899.5151.82

2.9樣品含量測定及質量評價 取來源于湖北、河南、山西、陜西4省18個野生青翹主產地的樣品，其中湖北產區樣品由本項目組于8月底采樣，并按項目組研究的產地加工方法規范加工，其他產區于9月底委托連翹產地藥商購于當地。18個樣品統一按“2.3”項制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣測定，測得18批樣品中連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁各成分含量見表3。采用AHP法進行積分，先對連翹各產地質量評價的決策建立層次結構模型，采用1～9 標度法對連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁3 項指標進行兩兩比較，按9分位比率評判各評價指標相對重要順序，列舉各評價指標的判斷優先矩陣。再按幾何平均法(根法)計算各指標的權重系數，得到連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁的權重系數分別為0.41，0.41，0.18。對求得的各個權重系數進行一致性檢驗，得到CI(一致性指標)=0，CR(隨機一致性比率)=0(<0.1)，說明評價指標層的判斷矩陣和單排序結果通過了一致性檢驗，所求得的權重系數有效，確定各有效成分的權重，再根據權重計算各樣品的綜合評分，結果見表3。

表3 各產地青翹中3種成分含量及質量綜合評價

Table.3Contentandqualityevaluationofthreeingredientsingreenfructusforsythiaefromdifferentregions

序號產地連翹苷連翹酯苷A蘆丁%綜合評分1湖北省十堰市鄖陽區①1.447.210.9995.552湖北省十堰市鄖陽區②1.237.591.1293.703湖北省十堰市鄖陽區③1.117.330.6881.824湖北省十堰市鄖陽區④0.926.930.8677.165湖北省十堰市鄖陽區⑤1.437.651.0598.596湖北省十堰市房縣①0.876.120.4564.807湖北省十堰市房縣②1.265.940.9983.628湖北省十堰市房縣③1.216.980.7383.599湖北省十堰市鄖西縣①1.414.500.6674.8710湖北省十堰市鄖西縣②0.922.300.4459.0711湖北省十堰市丹江口市1.176.810.9484.9212湖北省十堰市張灣區1.086.830.9482.4613湖北省十堰市竹山縣0.906.340.7070.8514陜西省商洛市丹鳳縣0.634.990.6054.3215河南省洛陽市嵩縣0.613.270.4041.3216河南省三門峽市盧氏縣0.693.380.4544.9917河南省安陽市林州市0.886.200.7770.6618山西省臨汾市襄汾縣0.493.350.3938.17

綜合評分Ki=各樣品連翹苷含量/連翹苷最高含量×0.41×100+各樣品連翹酯苷A含量/連翹酯苷A最高含量×0.41×100+各樣品蘆丁含量/蘆丁最高含量×0.18×100，i=1，2，3，……，18。

Comprehensive ScoreKi= the content of forsythin in each sample / the highest content of forsythin × 0.41 × 100 + the content of forsythiaside A in each sample / the highest content of forsythiaside A × 0.41 × 100 + the rutin content of each sample / the highest rutin content × 0.18 × 100,i= 1, 2, 3, …, 18.

3 討論

3.1UPLC法測定連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁含量方法的優化 《中華人民共和國藥典》2015年版連翹含量測定項下連翹苷及連翹酯苷A的供試品溶液需分開制備，連翹苷供試品溶液制備需經過靜置過夜、提取、蒸干、過氧化鋁柱、洗脫、濃縮至干、定容等步驟，測定2種成分處理供試品往往需要>3 d，耗時長，過程繁瑣，樣品回收率低。經過反復實驗發現以70%甲醇超聲提取40 min 時，采用 UPLC 結合梯度洗脫，用一個色譜條件同時檢測3種成分，在檢測波長277，330 nm時分別讀取連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁的數據計算含量，簡化了供試品制備步驟，有效提高了分析速度，提高了實驗方法精密度及重復性，并且通過實驗方法驗證該方法測定連翹苷、連翹酯苷A的含量與《中華人民共和國藥典》2015年版方法比較接近，因此該方法用于平行評價不同產地青翹的質量可行，同時為簡便快捷、有效地監控青翹質量提供了一種新檢測方法。

3.2各產區青翹質量綜合評價 青翹是大宗清熱解毒類中藥材[9]。筆者在本實驗中選擇《中華人民共和國藥典》2015年版連翹鑒別項連翹苷和連翹酯苷A含量及黃酮類成分蘆丁作為質量評價指標。對3種成分重要程度按AHP法進行重要性評判，按各成分權重計算每個樣品的綜合評分，用綜合評分來一測多評評價各產地青翹的綜合質量。從實驗結果來看，不同產區青翹藥材中主要成分含量有一定差異性。湖北省十堰市鄖陽區5批青翹樣品綜合評分平均達89.4分，普遍高于其他產區，尤其是連翹酯苷A含量高于其他產區。十堰市房縣產區①號樣采自30年樹齡老樹，連翹苷含量較低，是否與樹齡有關，有待項目組后期進一步研究。鄖西縣2批樣品中連翹酯苷A含量低于鄖陽區很多，是否與地理環境、氣候條件有關也有待后期進一步研究。山西、陜西、河南產區綜合評分低于湖北省十堰市，可能與加工不規范、不能與項目組于湖北省十堰市產區同步平行采收時間及加工方法有關。從本實驗結果可以看出，湖北省十堰市產區青翹綜合質量優于其他產區，可能與該區一直是野生連翹藥材傳統產區，采收野生青翹一直是當地藥農主要創收手段有關[10]。當地相關部門應重視規范連翹的采收時間及產地加工工藝，以保證該地區出產的道地野生青翹質量優質及均一，彰顯該藥材的道地性。