五味金色緩釋片處方篩選及其在比格犬體內藥動學研究*

朱燁，張潔，關志宇，林春蓮，顏潔，劉婧，黃瀟

(江西中醫藥大學藥學院，南昌 330000)

五味金色丸收載于《衛生部藥品標準·藏藥》，由訶子、木香、波棱瓜子、石榴子、黑冰片組成，方中訶子性平，味苦酸澀，歸肺、大腸經，具有濕腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽、調和藥性之功效[1]。丸劑多由原藥材粉碎加工制成，生產流程長，易受微生物污染。本實驗旨在以中醫臨床基本理論為指導，將已經為臨床實踐證明有確切療效的藏族醫學傳統經典復方五味金色丸制備成緩釋片劑，采用緩釋片劑的制備工藝實現市售緩釋丸劑同樣的釋藥效果，采用液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)考察五味金色緩釋片在比格犬體內藥動學過程，并與市售緩釋丸劑進行比較，以獲得藥物制劑進行體內評價的依據。

1 材料

1.1儀器 Applied Biosystems(AB)Triple Quad 5500液質聯用儀器(美國 Agilent 科技有限公司)，高速冷凍離心機(德國Sigma公司，型號：sigma3-18K)，電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司，型號：Secura225D-1CN，感量：0.01 mg)，DPH 單沖壓片機(湖南吉首市中誠制藥機械廠)，YD-20 型片劑硬度計(天津天大天發科技有限公司)。VORTEX GENIUS3渦旋儀(IKA儀器設備有限公司)，SZ-93自動雙重純水整流器(上海亞榮生化儀器廠)，超純水儀(南京易普易達科技發展有限公司)，BF-2000氮氣吹干儀(八方世紀公司)，KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，微量移液器(10～200 μL，100～1 000 μL，Eppendorf)。

1.2試藥 五味金色浸膏粉(自制)，五味金色丸(每10丸質量2.5 g，西藏藏醫學院藏藥有限公司，批準文號：國藥準字號Z54020101，批號：131201)；羥丙甲基纖維素(HPMC K4M，HPMC K15M，HPMCK100M，美國陶氏輔料有限公司)，乙基纖維素 10cp(山東瑞泰化工有限公司)，預膠化淀粉、微晶纖維素、蔗糖、乳糖(安徽山河藥用輔料有限公司，藥用級)，鞣花酸對照品(南昌貝塔生物科技有限公司，批號：10379-201310，每支50 mg，質量分數>98%)，去氫木香內酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111525-201209，含量：99.7%)，磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司，批號：201601002，含量：99.5%)；磷酸(分析純，批號：1102261，含量：99.5%)、氯化鈉(批號：160103，含量：99.5%)、無水乙醇(批號：16092702，含量：99.7%)均來自西隴化工股份有限公司，甲醇(色譜純，批號：MS1999-801，含量：99.9%)、乙腈(色譜純，批號：AS1022-801，含量：99.9%)均來自美國天地公司。

1.3實驗動物 雄性比格犬，體質量10 kg，購買于福州振和實驗動物技術開發有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(閩)2012-0002。飼養條件，溫度：16～26 ℃；相對濕度：40%～70%；噪聲≤60 dB；動物照度：100～200 lx，明暗各12 h交替。

2 方法與結果

2.1五味金色緩釋片的制備 按處方量稱取藥材，加8倍量70%乙醇，提取2 次，每次1.5 h。將提取液濃縮，200目篩(篩孔內徑75 μm)過濾，干燥，與各輔料分別粉碎過100 目篩(篩孔內徑150 μm)，于研缽中研磨，過100目篩混合2 次，充分混合均勻后，采用直接粉末壓片法制備片劑，壓強70～80N，每片約250 mg。

2.2總多酚得率測定 在釋放度實驗各取樣時間點，精密量取溶出液5 mL，微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過，分別置于10 mL量瓶，加福林試劑 2 mL，搖勻，靜置 5 min，加入10% 碳酸鈉2 mL，加水定容，搖勻，放置120 min，顯色后于 770 nm波長處有最大吸收峰。同法操作，作為空白溶液，計算總多酚含量與各相應時間的累計釋放量。

2.3處方考察

2.3.1緩釋材料的篩選 在以EC10cp作為阻滯劑的基礎上，考察緩釋輔料羥丙基甲基纖維素(HPMC K100M、HPMC K15M、HPMC K4M)，分別測定不同時間點緩釋片的總多酚累積釋放度，見圖1。實驗結果表明，以HPMC K15M 為骨架材料時，釋藥過程更平順，更符合零級釋藥曲線，所制備的五味金色緩釋片緩控釋效果最佳，故選擇HPMC K15M作為緩釋輔料，與EC 10cp聯合使用。

圖1 HPMC型號對溶出度的影響

2.3.2HPMC K15M 用量考察 以HPMC K15M為骨架材料，分別稱取占片重15%，20%，25%的HPMC K15M，其他輔料用量不變，按照制備工藝制備緩釋片，考察不同HPMCK15M 用量對釋放度的影響，見圖2。由結果可見，隨著HPMC K15M用量增加骨架片凝膠層增厚，藥物擴散速度減慢，藥物的釋放速度降低。當HPMC K15M用量為15%時存在突釋現象，緩控釋制劑的穩定性降低；當HPMC K15M用量為25%時，藥物釋放速度最低；當HPMC K15M 用量占片重的 20% 時，釋放曲線較好。

圖2 HPMC用量對溶出度的影響

2.3.3EC 10cp 用量考察 以EC 10cp為阻滯劑，分別稱取占片重20%，30%，40%的EC 10cp，其他輔料用量不變，按照制備工藝制備緩釋片，考察不同EC 10cp 用量對釋放度的影響，見圖3。由結果可見，當EC 10cp藥物釋放較快，存在突釋現象，EC 10cp用量為40%時藥物釋放過慢，故選擇占處方量30%的EC 10cp。

圖3 EC用量對溶出度的影響

2.3.4填充劑的篩選 保持處方中其他輔料用量不變，分別加入等量乳糖、可壓性淀粉、微晶纖維素、蔗糖作為填充劑，制備緩釋片(硬度70～80N)，對比不同填充劑對藥物釋放的影響，結果見圖4。以可壓性淀粉、蔗糖為填充劑時釋藥行為差異無統計學意義，但兩者壓成的片劑脆碎度均>1%，易松散掉粉，且前期和中期存在突釋現象；以微晶纖維素為填充劑的片劑藥物累積釋放度最小；以乳糖為填充劑的片劑，藥物釋放最理想，故選用乳糖作填充劑。

圖4 填充劑對溶出度的影響

2.3.5驗證實驗 原、輔料過100目篩，準確稱取處方量的提取物浸膏粉、HPMC K15M 、EC 10cp、乳糖、硬脂酸鎂，混合研磨，充分混合均勻后粉末直接壓片，片劑硬度控制在60～70N。其平均片質量為0.501 2，0.500 9，0.501 3 g，片質量差異合格范圍為±5%，均無超出范圍的片質量。測得藥物累積釋放度分別為95.1%，93.9%，94.6%，表明自制五味金色緩釋片緩釋效果較好。

2.4色譜和質譜條件 色譜條件：色譜柱為 Agilent C18(150 mm×4.6 mm)，流動相為0.1%甲酸水：乙腈，梯度洗脫(表1)，流速0.3 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，時間6 min。

表1 梯度洗脫條件

質譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，正離子檢測，掃描方式：多重反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式，質譜參數設置如下：離子源溫度(temperuture,TEM)為500 ℃，離子源電壓(ionspray voltage，IS)為5 500 V，氣簾氣(curtain gas，CUR)為35 psi(1 psi≈6.9 kPa)，霧化氣(ion source gas1，GS1)和輔助加熱氣(ion source gas2，GS2)為50 psi，碰撞氣(collision gas，CAD)為7。鞣花酸、去氫木香內酯和芍藥苷最優MRM參數見表2，詳見圖5。

表2 檢測成分質譜信息

Table.2Massspectruminformationofthedetectedcomponents

檢測物母離對m/z錐孔電壓/V碰撞能量/eV鞣花酸303.2→242.110022去氫木香內酯231.0→185.014019芍藥苷498.2→179.06023

2.5比格犬體內的藥動學研究

2.5.1給藥方案與血漿樣品采集 本實驗采用雙交叉實驗設計，將 6只受試比格犬隨機分成2組，一組先服用受試制劑后服用參比制劑，另一組先服用參比制劑后服用受試制劑，每次實驗間隔 1 周，給藥前禁食12 h，口服1片，置咽部，用溫水100 mL灌服。服藥后2 h開始飲水，4 h后開始進食，于用藥前30 min內采集空白血樣，口服后于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，24，30，36 h經后肢靜脈采血2 mL。將采集到的血樣置含肝素抗凝管中，4 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)，分離血漿，置-80 ℃冰箱保存待測。

2.5.2對照品溶液的制備 分別精密稱取鞣花酸、去氫木香內酯對照品約5 mg，置10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成502 μg·mL-1鞣花酸、503 μg·mL-1去氫木香內酯對照品儲備液。同法配制506 μg·mL-1芍藥苷內標溶液，于-4 ℃冰箱保存備用。

2.5.3樣品的處理 取血漿樣品 500 μL，置于10 mL離心管，加入20 μL芍藥苷內標溶液(1000 ng·mL-1)，加入50%磷酸溶液15 μL和1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液175 μL，渦旋振蕩混勻2 min，加入甲醇1 mL 和乙腈2.5 mL，混合沉淀蛋白，超聲處理20 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于45 ℃氮吹儀下空氣吹干，殘留物用甲醇400 μL溶解，渦旋振蕩2 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液[1-3]。

2.6方法學考察

2.6.1專屬性考察 分別取不同來源的 6 個空白血漿 500 μL，除不加入內標外，其他均按樣品處理方法處理(圖6A)；取質控樣品 500 μL，加入混標10 μL，除不加入甲醇外，其他均按樣品處理方法處理，得色譜圖(圖6B)；取比格犬給藥4.0 h后的血漿樣品，按“樣品的處理”項操作，得色譜圖(圖6C)。結果表明，空白血漿中內源性物質不干擾鞣花酸、去氫木香內酯和內標化合物的測定。

2.6.2線性關系考察 取犬空白血漿 500 μL，置于10 mL離心管，依次加入不同濃度鞣花酸和去氫木香內酯對照品溶液100 μL，配成鞣花酸濃度為5.02，20.08，40.16，60.24，80.32，100.4，150.60，251.5，301.20 ng·mL-1和去氫木香內酯濃度為1.006，20.12，40.24，60.36，80.48，100.6，150.9，251.5，301.8 ng·mL-1血漿樣品，按“2.5.3”項下方法處理，得鞣花酸線性方程為Y=0.011 5X+0.006 75(R=0.990 8)，去氫木香內酯線性方程為Y=0.005 09X+0.001 61(R=0.991 8)。

圖5 鞣花酸(A)、去氫木香內酯(B)和芍藥苷(C)質譜圖

A.空白血漿；B.對照品；C.口服五味金色緩釋片(25 mg·kg-1)4.0 h血漿樣品加入內標溶液；a.鞣花酸；b.去氫木香內酯；c.芍藥苷。

圖6 樣品色譜圖

A.blank plasma；B.reference substance；C.plasma sample (4.0 h after oral administration ofWuweiJinsesustained release tablets at 25 mg·kg-1) spiked with internal standard；a.ellagic acid；b.dehydrocostus lactone；c.paeoniflorin.

Fig.6Chromatogramofthesamples

2.6.3精密度和定量下限 取空白血漿500 μL，加入不同濃度對照品溶液100 μL，配制成高、中、低濃度質控樣品，按“2.5.3”項方法處理后進行液相色譜檢測，連續測定 3 d(n=6)，求得方法日內、日間精密度，結果見表3。本法測定血漿中鞣花酸、去氫木香內酯的定量下限為10 ng·mL-1。

表3 鞣花酸和去氫木香內酯在比格犬血漿中的日內與日間精密度

Table.3Inter-andintra-dayprecisionofellagicacidanddehydrocostuslactoneintheplasmaofbeagledogs

成分與濃度/(ng·mL-1)日內濃度/(ng·mL-1)RSD/%日間濃度/(ng·mL-1)RSD/%鞣花酸 109.86±0.969.749.25±0.818.76 5053.12±2.865.3851.30±1.653.22 250279.20±11.604.15276.42±15.185.49去氫木香內酯 109.37±0.687.269.53±0.778.08 5042.08±2.576.1143.13±2.966.86 250254.00±11.974.71269.00±17.536.52

2.6.4提取回收率和基質效應 取空白血漿，按照“2.5.3”項方法處理，配成鞣花酸和去氫木香內酯低、中、高濃度(分別為 10，50，250 ng·mL-1)血漿藥物溶液(n=6 )并記錄濃度(A1)，同時取空白血漿，沉淀蛋白，吹干后加入鞣花酸和去氫木香內酯和內標芍藥苷混合溶液，取樣測定，記錄濃度(A2)。另取上述 3 個用流動相配制的相同濃度對照品溶液直接進樣，測定濃度(B)，計算鞣花酸和去氫木香內酯低、中、高濃度的提取回收率[提取回收率(%)=(A1)/(A2)×100%]和基質效應[基質效應(%)=(A2)/(B)×100%]。結果見表4。

2.6.5穩定性實驗 取空白血漿500 μL，加入不同濃度對照品溶液100 μL，配制成高、中、低濃度質控樣品，測定處理后的血漿樣品室溫放置12 h、反復凍融3次、-20 ℃放置3 d穩定性。結果表明，測定偏差均在±15%內，表明血漿樣品在上述條件下穩定。

表4 鞣花酸和去氫木香內酯在比格犬血漿中的提取回收率和基質效應

Table.4ExtractionrecoveryandmatrixeffectofellagicacidanddehydrocostuslactoneintheplasmaofBeagledogs%，n=6

成分與加入濃度/(ng·mL-1)提取回收率RSD基質效應RSD鞣花酸 1087.066.6291.694.99 5094.786.96103.108.93 25093.883.7899.144.10去氫木香內酯 1085.815.7292.153.35 5092.2810.5997.8210.39 25091.466.9996.514.44

2.7實驗結果

2.7.1血藥濃度測定結果 比格犬口服五味金色緩釋片與五味金色丸各時間點血藥濃度-時間曲線見圖7和圖8。

五味金色緩釋片與市售緩釋丸劑藥動學參數比較，AUC差異無統計學意義，說明兩者吸收程度生物等效；t1/2、Cmax、MRT差異無統計學意義，提示緩釋片具有緩釋效果。緩釋片tmax顯著大于市售緩釋丸(P<0.05)。結果表明自制五味金色緩釋片在體內緩慢釋放，可較長時間維持有效血藥濃度，具有更好緩釋特征。

3 討論

藥物提取物成分較復雜，導致緩釋制劑處方設計和制備工藝較困難。因此輔料與藥物的充分研磨及研磨程度對提高片劑崩解和分散均勻性至關重要。HPMC 是最常見親水凝膠骨架材料，與不溶性骨架材料 EC 10cp聯合使用有較好的塑性變形能力，能夠將藥物粒子較好地包裹，降低藥物釋放速度[4]。

筆者在本實驗選用去氫木香內酯和鞣花酸兩種成分作為指標，鞣花酸內含有多酚二內酯，鞣花酸微溶于水，去氫木香內酯含有的倍半萜內酯類成分不溶于水。選擇兩種性質不同的成分作為藥動學含測指標，可更加全面地了解緩釋片在比格犬體內的藥動學規律。以芍藥苷為內標物，對照品與內標物分離度良好，且內源性物質對測定無干擾。經驗證，該方法精密度、重復性、回收率均符合生物樣品分析要求。

表5 比格犬口服給藥后鞣花酸及去氫木香內酯藥動學參數

劑型與成分Ka/(h-1)t1/2ztmaxhCmax/(μg·L-1)AUC0-∞AUC0-t(μg·L-1·h)MRT0-tMRT0-∞h五味金色緩釋片 鞣花酸1.22±0.1213.77±6.025.00±0.10215.67±22.374 142.76±308.532 566.10±656.0211.43±0.7127.23±2.91 氫木香內酯1.80±0.4510.81±11.634.00±0.170.99±0.1214.60±9.558.98±4.599.63±2.5722.45±14.47五味金色緩釋丸 鞣花酸2.03±0.3111.17±5.543.50±0.35①189.00±72.123 885.43±685.622 390.41±156.3312.48±0.1824.10±1.77 氫木香內酯2.26±0.6311.57±3.683.00±0.00①1.28±0.9018.40±9.2213.62±9.3710.59±0.0418.69±5.84

①與五味金色緩釋片比較，P<0.05。

①Compared with wuwei jinse sustained release tablets,P<0.05.

鞣花酸在24 h后血藥濃度出現上升階段。原因可能是鞣花酸在比格犬體內存在肝腸循環，鞣花酸分子在肝內生物轉化、在膽囊存儲、在膽汁中轉運和腸重吸收之間需要延遲一段時間[5]。

五味金色緩釋片具有較好的緩釋效果，且釋放更均勻，相同給藥劑量，五味金色緩釋片AUC略大于市售丸劑。傳統丸劑雖然緩釋性能不錯，但制備工藝原始，丸劑工藝是成型后干燥，批次間可能存在差異，常常造成丸劑質量及臨床療效不穩定。制備成片劑后，有利于質量控制并符合衛生標準，緩釋性能更加穩定，批次間差異較小。