基于網絡藥理學及分子對接技術分析黃連防治乙型肝炎與非酒精性脂肪肝的分子機制*

楊欣，李亞輝，沙宗閣，李堯鋒，楊長福

(貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴陽 550025)

乙型肝炎是危害人類健康的多發病之一，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起，我國是HBV感染高發區[1]。近年來，人們生活水平逐漸提高，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發病率逐年升高[1-2]。目前，出現了慢性HBV感染合并NAFLD的患者，通常認為乙型肝炎和NAFLD具有協同作用，可加重肝臟損傷[3]。所以預防乙型肝炎和NAFLD同時發生，防止因協同損傷作用誘發肝臟纖維化、肝硬化和肝癌等疾病的發生有重要意義。

黃連(CoptischinensisFranch.)藥用歷史悠久，有關該藥的研究主要集中在保肝、抗腫瘤和降壓等方面[4]。已經有研究表明，黃連素、黃連復方、黃連水提取物等在肝損傷、肝硬化、肝癌中發揮重要作用[5]。由于中藥化學成分眾多，采用動物實驗篩選抗HBV和NAFLD的活性成分及靶點工作量較大。隨著科學技術的發展，網絡藥理學和分子對接技術的出現，多學科的相互交叉，為中醫藥的發展增添了新思想和新技術，同時降低了實驗工作量和成本[6]。國內外對乙型肝炎和NAFLD之間的關聯性及影響研究筆者較少見到。筆者在本研究基于網絡藥理學、分子對接探討黃連防治乙型肝炎和NAFLD的分子機制，以期篩選最佳活性成分，為保肝藥物的開發及臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1在線軟件與數據庫 Cytoscape 3.5.1版軟件(http：//www.cytoscape.org)；DrugBank數據庫(http：//www.Drugbank.ca/)；可視化和集成發現的數據庫(Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https：// david.ncifcrf.gov/)；基因比較數據庫(Commparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/)；中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmspsearch)；UniProt 數 據 庫(http：//www.uniprot.org/uniprot/)；SYBYL2.1軟件(Tripos)。所有軟件運行于 Windows 操作系統平臺下(64位)，本項目使用的分析軟件均已獲授權或為開源軟件。

1.2活性成分潛在靶點篩選 在線TCMSP[7]，輸入“黃連”，設置相關參數：參照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug likeness，DL)、相對分子質量(molecular weight，MW)、脂水分配系數(lipid-water partition coefficient，ALogP)篩選黃連活性成分。TCMSP人體靶標數據來自 DrugBank 數據庫[8]。借助間接靶點預測(SysDT) 模型篩選黃連潛在靶標。采用隨機森林(random forests，RF) 和支持向量機(support vector machine，SVM)建立預測模型。黃連基于TCMSP在化學成分名稱中輸化學成分，統計靶標蛋白數目。基因靶標通過CTD查找。輸入黃連化學成分，顯示潛在靶標基因名稱。統計潛在靶標基因數目。將基因和蛋白名稱輸入UniProt 數據庫，查找Uniport ID，為通路分析做準備。

1.3靶點通路分析 DAVID是基于WEB服務器的富集分析軟件，可對靶標基因(蛋白)進行功能分析、疾病分析、通路分析。本研究基于DAVID 中的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG)對靶標進行通路富集分析，黃連活性成分84個靶點通過DAVID 6.8版在線進行分析，其數據庫可以進行靶點整合，將靶點整合到相同通路中進行分析。結果得到靶標蛋白參與的所有途徑，篩選出靶標蛋白顯著參與的途徑(P≤0.01)，通過Rstudio中的ggplot2繪制前25條通路，包括通路名稱、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.4蛋白互作網絡(protein protein interaction network，PPI)分析 PPI分析有助于從系統角度揭示疾病分子機制，發現新藥靶點，篩選關鍵靶點。STRING數據庫是一個搜索已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用的數據庫，可以通過蛋白名稱(protein by name)、蛋白序列(protein by sequence)、多個蛋白名稱(multiple proteins)和多條蛋白序列(multiple sequences)進行相互作用分析[8]。STRING用于字符串相關操作。基于實驗數據、PubMed文本數據挖掘的結果、其他數據庫數據，采用基因融合、系統進化譜、染色體臨近等生物信息學方法進行預測，最后以綜合打分形式衡量結果。對24個乙型肝炎靶點和15個NAFLD靶點進行PPI分析，將乙型肝炎和NAFLD通路中39個潛在靶標輸入STRING，輸入潛在靶點名稱，選擇人源。每一個節點代表一個蛋白，節點右上方為基因名稱，每一條邊代表潛在靶點之間的功能性關聯。基于開源的復雜網絡分析與可視化平臺Cytoscape3.5.1版進行繪制，根據度(degree)的大小篩選關鍵節點[9]。

1.5小分子的優化處理 基于SYBYL對黃連小分子加氫、加電荷[10]，每個分子進行最低能量優化及加氫處理，優化次數為10 000，選擇Tripos 標準分子力場和添加 Gasteiger-Hückel 電荷，基于 Powell能量梯度法優化得到最低能量構象，進行能量優化的目的是尋找配體分子的最低能量構象以模仿自然體系中的分子穩定構象，保存為SLN格式。

1.6黃連活性成分與靶標蛋白能量匹配 采用藥物分子設計模擬 SYBYL2.1 軟件的Surflex-Dock 模塊完成分子對接研究[11-12]。選擇具有實驗數據支持的靶標蛋白與黃連活性成分進行分子對接。蛋白質結構數據庫(protein databank，PDB，http：//www.rcsb.org/pdb )下載晶體結構[13]，結合文獻優先選擇復合了相應生物活性配體且分辨率較高的晶體結構[14-17]，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3 precursor，CASP3，PDBID：1RHQ)、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1，PDBID：3RJR)、白細胞介素- 6(IL-6，PDBID：1ALU)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopro teimase-9,MMP9，PDBID：966C)、基質金屬蛋白酶-3(MMP3，PDBID：1HY7)、促分裂素原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1，PDBID：2Y9Q)和促分裂素原活化蛋白激酶3(MAPK3，PDBID：4QTB)與黃連活性分子進行能量匹配，這些晶體分別在3.00 ?，3.05 ?，1.90 ?，1.90?，1.40 ?，1.55 ?，1.50 ?的解象下以X衍射方法獲得。將小分子結構數據庫中的低能構象與靶標進行柔性對接，對接過程中閾值參數0.5，膨脹系數1，其他參數為系統缺省值。選用 AMBER7 FF99 力場進行能量優化；另外選擇 Automatic 模式產生活性口袋，優化完畢后保存為 SFXC 文件作為對接文件，其他所有參數均采用SYBYL2.1默認值。利用Surflex-Dock分子對接模塊的 Total-Score 打分函數對小分子與靶標相互作用進行評分，Total-Score 函數綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大，對接復合物越穩定，說明小分子化合物與大分子蛋白質的匹配結合作用越好。以 Total-Score 等于 5為閾值，挑選對接效果好的化合物。

1.7相互作用分析 Ligplot作為經典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件，應用較廣泛，氫鍵和疏水作用基于HBPLUS程序計算，以2D形式展示結構。本研究基于Ligplot1.4.5軟件，將黃連活性最高的化學成分穆坪馬兜鈴酰胺與RACα絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、MAPK3、MMP9、MMP3、TGF-β1、CASP3、MAPK1分別合并(Merg命令)為PDB格式(Program Data Base)保存，導入Ligplot軟件，并自動計算形成的氫鍵、疏水作用和結構比對。

2 結果

2.1黃連活性成分篩選 在TCMSP數據庫中參照OB≥40%、DL≥0.18、-2≤ALogP≤5、MW≤500篩選黃連化學成分，結果見表1。

表1 黃連化學成分

Table.1ChemicalcomponentofCoptischinensisFranch

中文名稱英文名稱OB/%DLMWALogP廣玉蘭內酯magnograndiolide63.710.19266.371.18穆坪馬兜鈴酰胺moupinamide86.710.26313.382.86鹽酸巴馬汀palmatine64.600.65352.443.65(R)-四氫小檗堿 (R)-canadine55.370.77339.423.40槲皮素quercetin46.430.28302.251.50甲基黃連堿worenine45.830.87334.373.73表小檗堿epiberberine43.090.78336.393.45黃柏酮obacunone43.290.77454.562.68

2.2黃連活性成分潛在靶標 基于TCMSP、CTD及 Uniport查找黃連化學成分潛在靶標，其中鹽酸巴馬汀潛在靶標14個，(R)-四氫小檗堿潛在靶標3個，槲皮素潛在靶標63個，甲基黃連堿潛在靶標7個，表小檗堿潛在靶標10個，黃柏酮潛在靶標14個，共111個潛在靶標。除去相同的潛在靶標，黃連化學成分共有潛在靶標84個(圖1)。廣玉蘭內酯和穆坪馬兜鈴酰胺無潛在靶標，采用分子對接進一步研究。

紅色節點：靶標；藍色節點：化學成分。

Red node：target；blue node：chemical component.

Fig.1Interactionnetworkofcomponents-targets

2.3潛在靶標通路分析 采用DAVID 數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)對靶標蛋白進行通路注釋，得到靶標蛋白所參與的所有途徑，篩選出靶標蛋白顯著參與的途徑(P≤0.01)，84個差異蛋白共篩選出代謝途徑83條，采用R語言的ggplot2輸出前25條通路。25條通路中包括乙型肝炎(P-Value=3.5E-19)和NAFLD(P-Value=9.9E-8)通路(圖2)。

2.4乙型肝炎、NAFLD通路共有靶標分析 NAFLD通路包括潛在靶標15個，乙型肝炎通路包括潛在靶標24個。通過構建通路-靶標網絡模型(圖3)，發現CASP3、CASP8、 TGF-β1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-6、轉錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、AKT1、細胞凋亡調節因子BAX(apoptosis regulator，BAX)為乙型肝炎和NAFLD通路共有靶點。

圖2 潛在靶標通路分析

Fig.2Pathwayanalysisonpotentialtarget

紅色節點：疾病名稱；藍色節點：靶標蛋白；黃色節點：乙型肝炎和NAFLD共有靶標蛋白。

圖3 通路-靶標網絡模型

Red node：disease name;blue node：target protein;yellow nod：common target protein of HB and NAFLD.

Fig.3Networkmodelofpathway-target

2.5PPI分析 PPI分析結果顯示：整個網絡以MAPK1、細胞凋亡調節因子Bcl-2(Apoptosis regulator Bcl-2)、IL-6、MAPK3、AKT1(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)(degree>26)為中心節點緊密關聯。去掉中心節點，整個網絡渙散。進一步明確代表NAFLD和乙型肝炎的靶標相互關聯(圖4)。

2.6分子對接 Surflex-Dock 具有速度快、準確性高等特點，對接結果以Total Score、Crash和Polar 等參數值輸出。Surflex-Dock 打分函數是以-log10 為單位模擬結合能力，配體與受體結合穩定性以Total Score>5為閾值進行評價(表2)，黃連4個活性成分[穆坪馬兜鈴酰胺、鹽酸巴馬汀、槲皮素、 (R)-四氫小檗堿]能同時調節≥3個靶標蛋白，化學成分結構見圖5，通過分子對接進一步明確其關鍵靶標蛋白為MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3。

綠色：乙型肝炎和NAFLD通路共有靶標；紅色：乙型肝炎靶標；藍色：NAFLD靶標

圖4 靶標蛋白相互作用

Green：common targets of HB and NAFLD；Red：Hepatitis B targets；blue：NAFLD targets.

Fig.4Interactionoftargetprotein

2.7相互作用分析 本研究基于Ligplot1.4.5版軟件自動計算形成的氫鍵、疏水作用和結構比對(圖6)。化學成分穆坪馬兜鈴酰胺與7個關鍵靶標蛋白形成16氫鍵，63個氨基酸位點。可以推測表3中這些氨基酸殘基可能要尋找AKT1、 CASP3、TGF-β1、MAPK1、MAPK3、MMP9和MMP3的重要殘基，它們在決定酶的催化特性中起到了重要作用。

3 討論

中藥具有活性成分多、調節靶點多和藥理作用多等特點。網絡藥理學和計算虛擬平臺為化合物的篩選提供了較好的補充和替代手段。本研究基于整合平臺，研究了黃連保肝物質基礎，明確黃連中穆坪馬兜鈴酰胺、鹽酸巴馬汀、槲皮素、 (R)-四氫小檗堿是治療NAFLD、乙型肝炎主要活性成分。已經有研究表明[18-21]，槲皮素、小檗堿對急性肝損傷和NAFLD有保護作用。乙型肝炎患者肝臟解毒功能降低，肝臟合成、代謝、排泄等功能失常，甚至導致肝細胞壞死，使機體出現肝功能失代償體征。NAFLD主要特征為肝細胞大泡性脂肪變性綜合征，根據炎癥和纖維化級別分為單純性脂肪肝、肝硬化、NAFLD。NAFLD發病率逐年上升，與肥胖、血脂異常、糖尿病、代謝異常等諸多疾病關系密切。影響身心健康，預防和治療NAFLD、乙型肝炎成為臨床難題。目前，臨床主要采用降脂藥、調節胰島素、控制體質量等方式治療上述疾病，往往不良反應較大。筆者在本研究采用分子對接明確黃連活性成分，通過多成分-多靶點協同發揮治療NAFLD和乙型肝炎作用，明確MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3可能是黃連治療NAFLD和乙型肝炎關鍵靶點，其中CASP3為NAFLD和乙型肝炎的共有靶點。CASP3在多種疾病中發揮重要作用，影響細胞增殖、分化、凋亡等。研究表明，乙型肝炎患者CASP3高表達，CASP8和CASP9可以激活CASP3，CASP3主要執行促細胞凋亡作用[22]；MAPK1和MAPK3在MAPK信號通路起著重要作用，已知肝細胞癌發生、發展與MAPK信號通路最為密切[23]。黃連為經典清熱解毒中藥，保肝效果值得進一步研究，本研究可為細胞實驗和動物實驗靶點選擇、組分配伍提供理論參考。

表2 活性成分與靶標蛋白分子對接

A.廣玉蘭內酯；B.穆坪馬兜鈴酰胺；C.鹽酸巴馬汀；D.(R)-氫化小檗堿；E.槲皮素；F.甲基黃連堿；G.表小檗堿；H.黃柏酮。

圖5 黃連化學成分結構式

A.magnograndiolide；B.moupinamide；C.palmatine；D.(R)-canadine；E.quercetin；F.worenine；G.epiberberine；H.obacunone.

Fig.5StructuralformulaofchemicalcompositioninCoptischinensisFranch

表3 穆坪馬兜鈴酰胺與靶標蛋白形成的氫鍵及疏水作用

圖6 穆坪馬兜鈴酰胺與靶標蛋白相互作用分析

Fig.6Analysisoftheinteractionbetweenmoupinamideandtargetprotein