血管活性腸肽及其受體在嗜酸性粒細胞性胃腸炎兒童胃黏膜中的表達及其臨床意義

王婧，趙煜，張書紅，李妍，李靜

（天津市兒童醫院 消化科，天津 300134）

嗜酸性粒細胞性胃腸炎（eosinophilic gastroenteritis,EG）是兒童較為常見的胃腸道疾病，其主要臨床特征是胃腸道局限性或彌漫性嗜酸性粒細胞（Eosinophilic,EOS）異常增多、浸潤，可累及食管到直腸的任一部位，其中胃最易受到影響[1]。目前關于EG 的發病機制存在多種觀點，其中變態反應、遺傳因素、免疫功能異常、營養因素、藥物、食物等可能參與EG 的發病[2-3]。血管活性腸肽（vasoactive intestinal polypeptide,VIP）是廣泛分布在胃腸黏膜的一種非膽堿能非腎上腺能神經遞質，其具有調節胃腸道的生理、生化、免疫功能，以及抗炎、免疫、舒張平滑肌等多種功能[4]。相關研究已證實采用霧化吸入VIP 法可減輕哮喘發作程度，并抑制氣道重塑[5]。VIP作用于其受體（VPAC），其是與G 蛋白耦聯的7 次跨膜糖蛋白，2 種受體亞型為VPAC1 和VPAC2。研究表明，VPAC1 可能與腹瀉型腸易激綜合征有關[6]，VPAC2 可能與特發性蕁麻疹過程中肥大細胞的脫顆粒作用有關[7]。目前關于VIP、VPAC1 和VPAC2 與兒童EG 之間的關系研究較少，因此，本文通過研究兒童胃黏膜中VIP 及其受體表達的變化，進一步探討其在兒童EG 中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年11月—2018年12月天津市兒童醫院消化科收治的EG 兒童50 例作為研究對象（EG 組）。其中，男性34 例，女性16 例；年齡0.4～10 歲，平均（4.33±2.55）歲。同時選取胃鏡下病理活檢EOS＜ 10 個/高倍視野（HPF），免疫球蛋白（IgE）檢測正常的同一年齡段的急性腸胃炎兒童50 例作為對照組。 其中，男性33 例，女性17 例；年齡0.5～10.0 歲，平均（4.29±2.50）歲。EG兒童納入標準：根據TALLEY標準[8]，臨床表現為反復腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等。排除標準：患兒有幽門螺桿菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、炎癥性腸病、變應性紫癜、自身免疫性疾病、結核、功能性胃腸病等疾病。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司），超微量分光光度計（北京凱奧科技公司），ABI 7900 PCR 儀（美國ABI 公司），GBox F3 凝膠成像系統（英國Syngene 公司），-80℃冰箱（中科美菱公司）。

1.2.2 試劑 Trizol（美國Ambion 公司），PCR 試劑盒、DNA Mark DL500（大連寶生生物工程有限公司），引物合成（北京六合華大基因科技股份有限公司），氯仿、異丙醇、瓊脂糖、溴化乙錠（北京中生瑞泰科技有限公司）。

1.3 VIP、VPAC1、VPAC2 的RT-PCR 檢測

分別兩組胃黏膜組織標本，離體10 min 內迅速投入液氮中保存，提取RNA 并行逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測，分別加入VIP、VPAC1、VPAC2的引物進行RT-PCR 擴增，RT-PRC 反應體系為：Sybr Premix Ex Taq（2×），10 μl；正向引物和反向引物分別為（20 μmol/L）0.2 μl，Rox Peference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 2 μl，dH2O 7.2 μl。擴增條件：94 ℃變性45 s，60.2℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35 個循環；72℃繼續延伸10 min。產物-20℃冰箱冷凍保存。用2-△△Ct法對RT-PCR 的結果進行相對定量分析，2-△△Ct表示EG組相對于對照組的擴增倍數，△△Ct=CtEG組-Ct對照組。

1.4 觀察指標

患兒入院后檢測其外周血EOS 計數、IgE 水平，胃鏡檢查其黏膜變化。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以 均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。采用Logistic回歸模型分析EG 的相關因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒一般資料比較

兩組患兒性別、年齡、過敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

2.2 兩組患兒外周血EOS、IgE 及胃鏡檢查結果比較

兩組外周血EOS、EOS%、IgE 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），EG 組高于對照組；兩組胃鏡下黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結節樣隆起或增生例數比較，差異有統計學意義（P＜0.05），EG 組多于對照組。見表2。

2.3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的表達比較

兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），EG 組低于對照組。見表3。

2.4 EG 影響因素分析

將患兒是否為EG 作為因變量，將年齡、性別、過敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結節樣隆起或增生、VIP、VPAC1 及VPAC2 mRNA 作為自變量，建立模型進行單因素Logistic 回歸分析，結果表明，便血、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 為EG 影響因素（P＜0.05）（見表4）；將單因素分析有統計學意義的以上因素納入Logistic 回歸模型作多因素分析，結果表明VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 是EG 的獨立影響因素（P＜0.05）（見表5）。

表1 兩組患兒一般資料比較（n =50）

表2 兩組患兒EOS、IgE 及胃鏡檢查結果比較（n =50）

表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對表達水平比較（n =50，±s）

表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對表達水平比較（n =50，±s）

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表4 EG 影響因素的單因素Logistic 回歸分析參數

續表4

表5 EG 影響因素的多因素Logistic 回歸分析參數

3 討論

近年來，由于各種因素如環境、飲食等方面的變化，兒童EG 的發病率逐年升高。EG 是以胃腸道EOS 異常浸潤為特征的一種胃腸道疾病，可累及胃竇部、近端空腸、回腸、結腸、食管、腸系膜、淋巴結等。EG 的臨床表現呈多樣性，且無特異性，臨床主要特征為腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等，若不能早期診斷并予以早期治療，可導致病情延誤或反復發作。目前，EG 的診斷主要依賴于胃腸鏡下多點活檢[9]（≥6 個部位），且病理染色示有1 處以上EOS＞20 個/高倍視野（HPF）[8-9]。因此，EG 的特異性診斷具有重要臨床意義。

有研究表明[10]，EG 患者外周血EOS 計數及總IgE 水平升高，可提示疾病的嚴重程度。本研究結果亦顯示EG 組患兒EOS、EOS%、IgE 水平高于對照組。分析原因可能是由于外界過敏原侵入胃腸道后，可選擇性地誘導特異性B 細胞產生大量IgE 抗體，該抗體可與MC 表面的高親和力受體FcεRI 結合而引起機體過敏；當該過敏原再次侵入胃腸道時，使得MC 表面的FcεRI 受體交聯活化，導致MC 發生脫顆粒反應而釋放大量EOS 趨化因子、炎癥因子（前列腺素、白三烯等）及細胞因子（IL-5、TNF-α、IFN-γ 等），最終導致EOS 浸潤，引起組織損傷。

VIP 是人體分布較為廣泛的一種神經肽，共28個氨基酸殘基，屬于非膽堿能、非腎上腺素能神經遞質和腦-腸肽物質的一種，對人體免疫力以及內分泌具有較好的調節作用，其可抑制巨噬細胞，調節T細胞生成。VIP 是胃腸道黏膜中含量較為豐富的神經內分泌肽，具有抑制胃腸道環形平滑肌的作用[11]。由于人體胃腸道黏膜中的VIP 較為豐富，可與周圍肥大細胞、EOS 相互作用，形成神經-內分泌-免疫系統[12]。另有報道[13]，VIP 可抑制EOS 的遷移，增強EOS 浸潤，從而導致食管動力障礙。錢淑怡等[14]研究發現，EG 患兒胃竇黏膜中VIP 及VPAC2 水平與外周血EOS數量、總IgE 水平均呈負相關。本研究結果顯示，EG組患兒VIP mRNA 低于對照組；Logistic 回歸分析結果表明VIP mRNA 是EG 的獨立影響因素。結果表明，VIP mRNA 是EG 的獨立影響因素，可反應是否發生EG，有助于臨床診斷。

阮族明等[15]研究發現，胃腺癌組織中VPAC1 表達量低于正常胃黏膜。許惠娟等[16]研究發現，腸易激綜合征大鼠VPAC1 表達量高于正常組，模型大鼠由于結腸黏膜組織產生大量VPAC1 和VIP，使結腸組織細胞AQPs 的表達受到影響，進而使得結腸上皮細胞紊亂而分泌大量水份及電解質，最終導致腹瀉的發生。目前關于EG 與VPAC1 的表達研究較少，本研究結果顯示，EG 組患兒VPAC1 相對表達水平低于對照組；Logistic 回歸分析結果表明VPAC1 mRNA 是EG 的獨立影響因素。結果表明，VPAC1 mRNA 可較好地反映EG 的發生，有助于早期診斷。

VPAC2 受體是由位于VIPR2基因位于染色體7q36.3 區域進行編碼。VPAC2 是VIP 以及垂體腺苷酸環化酶活性肽（PACAP）的共同受體，VPAC2 與PACAP、VIP 相結合后，使蛋白構象發生改變，可導致細胞內環腺苷酸（cAMP）水平升高，進而導致細胞代謝水平發生變化。錢淑怡等[14]采用免疫組織化學法檢測EG 患者胃竇黏膜組織中VIP 及VPAC2 含量，結果顯示EG 組患者與對照組比較，VIP 及VPAC2 含量降低。JAIN[7]研究表明，慢性特發性蕁麻疹中VIP 通過作用于VPAC2，進而調節肥大細胞的脫顆粒過程。本研究結果顯示，EG 組患兒VPAC2 mRNA 低于對照組；Logistic 回歸分析結果表明VPAC2 mRNA 是EG 的獨立影響因素。結果表明，VPAC1 mRNA 減少可能與EG 的發生有關。

吳昌歸等[17]研究發現，VIP 可抑制血小板激活因子誘導的EOS 嗜酸性過氧化物酶活性的增加效應，對EOS 的脫顆粒反應以及EOS 與血管內皮細胞的黏附起抑制作用，結合本研究結果推測，胃竇黏膜VIP、VPAC1 及VPAC2 含量降低后，使得VIP 與VPAC1 及VPAC2 結合減少，進而對EOS 與胃竇血管內皮細胞黏附、浸潤的作用降低，導致胃黏膜 EOS 聚集并發生脫顆粒反應，從而釋放大量損傷性介質，最終導致EG 的發生。

綜上所述，EG 兒童胃黏膜VIP 水平降低，VPAC1及VPAC2 mRNA 下降，可能與兒童胃黏膜EG 的發生、發展相關，有助于臨床早期診斷并早期干預。另外，本研究結果提示，在臨床EG 患者的治療中，可嘗試提高VIP 水平，促進VIP 與VPAC1 及VPAC2 的結合，進而可能抑制EG 的發展，對臨床EG 的治療具有重要指導意義。