慢病毒介導的microRNA-19b表達對鼻咽癌細胞凋亡及Wnt/β-catenin信號的影響

王申，金建平，夏兵華，常濤

（蘇州市第九人民醫院 耳鼻咽喉科，江蘇 蘇州 215200）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，具有生長隱匿、不易早期診斷、較早發生淋巴結轉移等特點。其發生、發展是一個多途徑、多階段、多機制積累及多遺傳變異的復雜過程。抑癌基因失活、癌基因激活及其之間的互作失衡是鼻咽癌發生、發展的分子機制[1-3]。因此，尋找影響鼻咽癌發生、發展相關基因，并進一步研究其機制，對該病的診療具有重要意義。microRNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，可控制細胞的增殖、凋亡、分化等多種生物進程，在腫瘤中充當癌基因或抑癌基因作用，并可調控下游的一些靶基因影響腫瘤的發生、發展[4]。多項研究表明，miRNAs 異常表達與鼻咽癌發生、發展密切相關[5-6]。miR-19b 是miRNAs 家族中的一員，有研究發現，鼻咽癌中miR-19b 的表達升高，與淋巴結轉移、分期等有關，可能作為潛在的鼻咽癌診斷標志物[7]。鼻咽癌患者血清中miR-19b 表達水平升高。研究提示miR-19b 可能在鼻咽癌發生、發展過程中發揮重要作用[8]。有研究表明，miR-19b-3p 可通過靶向TNFAIP3/NF-κB 調控鼻咽癌放療敏感性[9]。但目前miR-19b 對鼻咽癌細胞凋亡影響及機制尚未明確。因此，本研究旨在抑制或表達miR-19b 對鼻咽癌細胞系HONE1 增殖凋亡的影響，并進一步研究引起細胞增殖凋亡的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2018年8月蘇州市第九人民醫院收治的鼻咽癌患者40 例作為研究對象，同時收集癌旁組織作為對照。所有標本經病理證實均為鱗癌。其中，男性27 例，女性13 例；年齡19～85 歲。所有患者術前均未接受放化療及其他治療，且均為首次確診，研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

人永生化鼻咽上皮細胞系NP69 及鼻咽癌細胞系HONE1、5-8F 和CNE1 購自美國ATCC 公司。miR-19b 抑制表達（miR-19b inhibitor）、miR-19b 過表達和無意義序列（Scrambled）的慢病毒載體（miR-19b mimics）由上海吉瑪生物制藥有限公司構建。MTT 及RNA 提取試劑盒購自美國Gibco 公司，Annexin V-APC 和7-AAD細胞凋亡檢測試劑及流式細胞儀購自美國BD 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒購自美國Thermo 公司，Ki-67、p53、β-連環蛋白（β-catenin）抗體，細胞周期素D1（Cyclin D1）和C-myc購自美國Cell signal 公司，PCR 擴增儀購自美國ABI 公司，酶標儀購自美國Thermo Labsystem 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 細胞在含10% FBS 的RPMI 1640 培養基中，于體積分數5%二氧化碳CO2、95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.3.2 鼻咽癌組織及細胞中miR-19b 的表達 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。Trizol 法提取鼻咽癌細胞及組織總RNA，逆轉錄總RNA 為cDNA，以cDNA 為模板，使用qRT-PCR 儀進行PCR反應，PCR 的反應體系為20μl。PCR 反應體系及反應條件參照PCR 反應試劑盒說明書。以U6 作為內參基因，根據反應所得Ct 均值，采用2-△△Ct法計算miR-19b 相對于內參的表達量。

1.3.3 慢病毒轉染HONE1 細胞 構建miR-19b 抑制表達（miR-19b inhibitor 組）、miR-19b 過表達（miR-19b mimics 組）和無意義序列（Scrambled 組）的慢病毒載體，并設定空白組。以最佳的MOI 值轉染 HONE1細胞，慢病毒轉染細胞參照慢病毒包裝與使用工具手冊，收集慢病毒轉染細胞成功的細胞，參照1.3.2 方法檢測各組細胞miR-19b mRNA 相對表達量。

1.3.4 細胞活性檢測 采用MTT 法檢測各組細胞活力。胰酶消化HONE1 細胞，調整細胞濃度為3×103個/ 孔，按200 μl/孔接種于96 孔板，接種24 h 后將空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組轉染細胞，于轉染后的24、48 和72 h 收集細胞，每孔細胞中加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，置于37℃培養6 h，棄掉上清液，每孔中加入DMSO 200 μl，輕微震蕩混勻20 min，酶標儀測定570 nm 處各孔的吸光度值（A 值）。實驗重復3 次。

1.3.5 細胞凋亡檢測 收集生長至對數期的細胞，將細胞懸液濃度調整為6×104個/ml，鋪細胞于6 孔板，置于37℃、5% CO2培養箱培養24 h 后進行轉染，轉染48 h 后加入干擾素-α（IFN-α）（10 000 IU/ml），72 h 后采用Annexin V-APC 和7-AAD 雙染法，通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。具體操作參照試劑盒。實驗重復3 次。

1.3.6 Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和c-myc蛋白表達檢測 細胞中加入裂解液提取細胞總蛋白，BCA 檢測試劑盒測定蛋白濃度，每泳道取等量的蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳結束后電轉移至PVDF 膜，電轉好的PVDF 膜置于封閉液中2 h，洗膜，加入一抗4℃過夜，一抗Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc均按照1∶500稀釋，內參GAPDH按照1∶1 000稀釋，洗膜，次日加入二抗，洗膜后常溫孵育二抗（1∶2 000 稀釋HRP 標記的羊抗兔）2 h，洗膜，顯色液顯色，暗室環境進行壓片、顯影、定影。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，多組間進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-19b 在鼻咽癌組織及細胞中的表達

以癌旁組織中miR-19b 的表達及人永生化鼻咽上皮細胞系NP69 中miR-19b 的表達為1，qRT-PCR 結果顯示，鼻咽癌組織miR-19b 表達為（5.13±0.52），高于癌旁組織表達（1.01±0.10）（t=48.847，P=0.000）；NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 細胞中miR-19b 表達分別為（1.00±0.00）、（6.63±0.61）、（5.15±0.51）和（5.63± 0.50），4 組細胞miR-19b 表達水平比較，差異有統計學意義（F=83.447，P=0.000），鼻咽癌細胞中miR-19b 表達高于NP69 細胞（HONE1：t=255.188，P=0.000；5-8F：t=114.085，P=0.000；CNE1：t=259.424，P=0.000）。選取HONE1 細胞作為研究對象。見圖1、2。

2.2 miR-19b 在HONE1 細胞中的表達

通過qRT-PCR 檢測抑制或過表達miR-19b后HONE1 細胞miR-19b 的表達情況，與空白組（1.00±0.16）比較，Scrambled 組、miR-19b inhibitor 組、miR-19b mimics組細胞中miR-19b的表達分別為（1.03± 0.02）、（0.22±0.02）和（4.52±1.13），4 組細胞miR-19b 的表達水平差異有統計學意義（F=34.011，P=0.000）。Scrambled 組與空白組比較，差異無統計學意義（t=0.104，P=0.763），與空白組比較，miR-19b inhibitor 組miR-19b 的表達降低（t=70.200，P=0.001），miR-19b mimics 組miR-19b 的表達升高（t=28.538，P=0.006）。見圖3。

圖1 miR-19b 在鼻咽癌及癌旁組織中的表達（±s）

圖2 miR-19b 在4 種細胞中的表達（±s）

圖3 miR-19b 在各組細胞中的表達（±s）

2.3 miR-19b 對HONE1 細胞活力的影響

通過MTT 法檢測各組細胞活力，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組24 h 的OD 值分別為（0.61±0.06）、（0.56±0.06）和（0.78±0.07），48 h 的 OD 值分別為（0.80±0.09）、（0.43±0.05）和（1.34± 0.13），72 h 的OD 值分別為（0.85±0.10）、（0.31±0.04）和（1.89±0.22），3組24、48、72 h 的OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD 值有差異（F=255.817，P=0.004）；②3組的OD值有差異（F=164.528，P=0.006）；③3組的OD 值變化趨勢有差異（F=141.676，P=0.007）。與空白組比較，miR-19b inhibitor 組在48 和72 h 細胞活力降低（t=41.656 和88.657，P=0.003 和0.001），而miR-19b mimics組在48 和72 h 細胞活力升高（t=38.009 和55.721，P=0.004 和0.001）。見圖4。

2.4 miR-19b 對HONE1 細胞凋亡的影響

圖4 各組不同時間的OD 值比較（±s）

采用Annexin V-APC 和7-AAD 雙染法，通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組細胞凋亡率分別為（12.88±1.32）%、（19.17±1.45）%和（6.21±0.74）%，3組比較，差異有統計學意義（F=86.061，P=0.000）；與空白組比較，miR-19b inhibitor 組細胞凋亡率升高（t=30.870，P=0.005），miR-19b mimics 組細胞凋亡率降低（t=58.282，P=0.002）。見圖5、6。

2.5 miR-19b 對HONE1 細胞Ki-67、p53、β- catenin，Cyclin D1 和C-myc 表達的影響

Western blotting 檢測各組細胞中增殖相關蛋白Ki-67、凋亡相關蛋白p53 及β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc 的蛋白表達，空白組、miR-19b inhibitor 組和miR-19b mimics 組Ki-67 蛋白表達量分別為（0.29± 0.03）、（0.12±0.02）和（0.48±0.06），p53 蛋白表達量分別為（0.13±0.02）、（0.25±0.03）和（0.05±0.01），β-catenin 蛋白表達量分別為（0.16±0.020）、（0.09± 0.01）和（0.36±0.04），Cyclin D1 蛋白表達量分別為（0.25±0.03）、（0.11±0.01）和（0.41±0.05），C-myc 蛋白表達量分別為（0.30±0.03）、（0.11±0.01）和（0.44±0.04）；3組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1和C-myc 表達差異有統計學意義（F=59.769、88.383、53.133、70.783 和83.650，P=0.000、0.000、0.002、0.000 和0.000）；與空白組比較，miR-19b inhibitor 組Ki-67 和β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達降低（t=59.769、76.568、63.362 和83.465，P=0.000、0.000、0.001和0.001），p53 的表達升高（t=45.522，P=0.003）；與空白組比較，miR-19b mimics 組Ki-67、β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達升高（t=23.458、53.133、29.546 和83.450，P=0.008、0.002、0.006 和0.000），p53 的表達降低（t=47.041，P=0.002）。見圖7、8。

圖5 流式細胞儀檢測結果顯示各組的細胞凋亡情況

圖6 各組的細胞凋亡率的比較（±s）

圖7 各組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白的表達（Western blotting）

圖8 各組Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白相對表達量比較（±s）

3 討論

MicroRNA（miRNA）由22～25 個核苷酸組成，是一種內源性的單鏈非編碼小分子RNA，在腫瘤中可能是一類潛在的癌基因或抑癌基因，可通過與靶基因的配對結合而調控靶基因表達[10]。目前已有大量研究證實，miRNAs 表達及功能失調影響腫瘤發生、發展[11-12]。有研究顯示，miR-143 能夠抑制鼻咽癌細胞CNE-2Z 的增殖、遷移和侵襲能力[13]。miR-324-3p可能通過誘導EMT 改變調控鼻咽癌細胞的侵襲轉移能力[14]。提示miRNAs 可能對鼻咽癌的診斷、治療及預后評價有重要意義。miR-19b 是miRNAs 家族中的一員，可影響多種腫瘤的生物學過程[15]，在鼻咽癌中表達升高，但對其生物學特性研究還未清楚。

本研究中抑制或過表達miR-19b 的慢病毒轉染EBV 陰性鼻咽癌細胞系HONE1，獲得穩定的慢病毒轉染細胞細胞后，通過MTT 法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測其對IFN-α誘導的細胞凋亡的影響，結果顯示，抑制miR-19b 表達的鼻咽癌細胞活力降低，凋亡率增加，而過表達miR-19b 的鼻咽癌細胞活力升高，凋亡率降低。提示miR-19b 對鼻咽癌發生、發展的影響。Ki-67 是一個可標記細胞增殖狀態的抗原，與多種腫瘤的增殖有密切關系，能可靠和全面地反映細胞的增殖狀態，目前已在細胞增殖研究中有廣泛應用[15]。Ki-67在鼻咽癌中的研究相對較少，但有研究發現其可影響鼻咽癌細胞增殖，且可作為鼻咽癌預后判斷的一個獨立指標[16]。p53是一個重要的抑癌基因，有啟動細胞凋亡、阻滯細胞周期等作用，其失活是多種腫瘤發生、發展的一個重要事件[17]。鼻咽癌中p53 的活化可誘導癌細胞的凋亡[18]。為檢測miR-19b 引起鼻咽癌增殖凋亡的機制，本研究進一步檢測miR-19b 對Ki-67和p53 表達的影響。結果顯示，抑制miR-19b 表達可下調Ki-67 表達，上調p53 表達，而過表達miR-19b可上調Ki-67 表達，下調p53 表達。提示miR-19b 可通過調節Ki-67 和p53 表達影響鼻咽癌增殖和凋亡。Wnt/β-catenin 信號通路是細胞內一條重要的信號途徑，參與細胞增殖、凋亡、分化等過程的調控，與多種腫瘤的發生密切相關，且在多種腫瘤中出現異常激活[19-20]。抑制Wnt/β-catenin 信號通路可降低鼻咽癌細胞生長[21-22]。本研究檢測各組細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表達，結果顯示，抑制鼻咽癌中miR-19b 的表達可下調β-catenin、Cyclin D1 和c-myc 的表達，而過表達miR-19b 可上調β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 表達。提示miR-19b 可通過下調Wnt/β-catenin 信號通路降低鼻咽癌的發生、發展。

綜上所述，抑制miR-19b 表達載體轉染鼻咽癌HONE1 細胞可降低細胞活力，誘導細胞凋亡及下調Wnt/β-catenin 信號通路，降低細胞活力方式是下調Ki-67 表達，誘導細胞凋亡方式是上調p53 表達，而轉染過表達miR-19b 載體反之。本研究提示miR-19b可能是鼻咽癌診療的一個有效的分子靶點。