鹽酸小檗堿對肝星狀細胞自噬和凋亡的影響*

張建，趙紅偉，胡義亭，張大雷，高俊茶，鄭吉敏，王玉珍

（1.河北省人民醫院 消化內科，河北 石家莊 050051；2.河北大學附屬醫院 消化內科，河北 保定 071000）

肝纖維化是肝硬化形成的必經階段，肝星狀細胞（hepatic stellate cells,HSCs）在肝纖維化形成過程中起關鍵作用[1-2]。誘導HSCs 凋亡可以抑制肝纖維化，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是調節細胞凋亡的重要分子[3-4]。自噬可以保持細胞內環境穩定，實現某些細胞器的更新[5]，自噬可以促進HSCs 的活化[6-7]。活化c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases,JNK）信號可以促進HSCs 自噬[8]。鹽酸小檗堿可以通過阻斷Akt 信號通路促進肺癌細胞、惡性膠質瘤細胞、肝癌細胞的凋亡[9-11]。鹽酸小檗堿可以抑制心肌細胞自噬[12]。本文研究鹽酸小檗堿對HSCs 凋亡和自噬的影響，進一步探討鹽酸小檗堿影響HSCs 凋亡和自噬發生的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

HSC-LX2 細胞（無錫博慧斯生物醫藥科技有限公司），鹽酸小檗堿片（東北制藥沈陽第一制藥有限公司，規格：10 g/瓶），膜聯蛋白（Annexin-V）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司），半胱天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate-specific protease-3,Caspase-3）活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Caspase-3、肌球蛋白樣卷曲螺旋蛋白1（coiled-coil myosin-like Bcl-2 interaetig protein 1,Beclin1）、自噬相關基因5（autophagy-related gene 5,Atg5）、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK、GAPDH 抗體（美國Santa Cruz 公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）引物及Trizol 試劑盒、Prime ScriptTM逆轉錄體系（RT reagent Kit）、SYBR ? Premix Ex TaqTMKit 體系（北京賽百盛基因技術有限公司）。

1.2 細胞干預方法與實驗分組

鹽酸小檗堿用無菌蒸餾水溶解，置入-20℃冰箱冷凍保存。HSC-LX2 細胞低血清饑餓12 h，同時分成以下各組：溶劑對照組（1‰ DMSO）、鹽酸小檗堿5 μg/ml 組、鹽酸小檗堿10 μg/ml 組、鹽酸小檗堿20 μg/ml 組。細胞被干預24 h 后，進行流式細胞術、Western blotting 及qRT-PCR 檢測。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測HSCs 凋亡率及Caspase-3 陽性細胞熒光強度 干預細胞后應用激發光為488 nm波長的FACS Calibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）檢測各組HSCs 凋亡率。用Mod Fit LT 軟件分析結果。干預后的細胞加入1∶500 的鼠抗Caspase-3 一抗，再加入兔抗鼠IgG（1∶100）二抗，上機檢測。以10%雞紅細胞與樣品同步染色，作為內參。應用Expo 32 ADC 進行免疫熒光數據分析，用Expo 32 ADC分析軟件對Caspase-3 陽性細胞熒光強度進行分析。

1.3.2 MTT 法檢測Caspase-3 活性 檢測樣品蛋白濃度，按Bradford 蛋白濃度測定試劑盒使用說明書，用酶標儀測定595 nm 波長處的吸光度，計算標準曲線。上述方法分組及干預細胞之后，按試劑盒使用說明用酶標儀測定595 nm 波長處的吸光度，依據標準曲線計算蛋白濃度。

1.3.3 qRT-PCR 檢測mRNA 表達 提取培養細胞（約1×107個）總RNA，檢測Caspase-3、Beclin1、Atg5、Akt 及JNK mRNA 的表達。紫外分光光度計檢測RNA 的含量及純度并逆轉錄合成cDNA。Caspase-3、Beclin1、Atg5、Akt、JNK、GAPDH引物見表1。目的 基因定量拷貝數=2-△△Ct，Ct 值是熱循環儀中熒光達到熒光閾值的循環數，根據△Ct實驗組=Ct目的基因-CtGAPDH，△Ct對照組=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，對每一標本計算目的基因的拷貝數。

1.3.5 Western blotting 檢測Beclin1、Atg5、Akt、p-Akt、JNK 及p-JNK 蛋白的表達 干預結束后提取HSCs內總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白上樣，變性，轉膜，封閉，加入I 抗Beclin1、Atg5、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK蛋白及GAPDH（1∶200 至1∶1 000）4℃過夜；次日加入堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗（1∶5 000）孵育2 h，化學發光法顯影液曝光顯影。Image-Pro Plus 6.0軟件對Western blotting 結果進行定量分析，灰度值以累積吸光度表示，結果以目的蛋白與GAPDH 的灰度值比值表示。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 結果

2.1 鹽酸小檗堿促進HSCs 凋亡

4 組HSCs 凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；鹽酸小檗堿20 μg/ml 組與溶劑對照比較，細胞凋亡增加[（24.22±1.8）% VS（1.61±0.11）%，P＜0.05]（見圖1A、B 和表2）。為進一步研究鹽酸小檗堿對HSCs 凋亡的影響，采用流式細胞術檢測Caspase-3 陽性 細胞熒光強度，4 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸小檗堿5、10 和20 μg/ml 組與溶劑對照組比較，Caspase-3 陽性細胞熒光強度增加（P＜0.05）（見圖1C、D 和表2）。MTT 法檢測Caspase-3 蛋白活性，4 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸小檗堿5、10和20 μg/ml 組與溶劑對照組比較，Caspase-3 蛋白活性增加（P＜0.05）（見圖1E 和表2）。qRT-PCR 檢測Caspase-3 mRNA 表達，4 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組與溶劑對照組比較，Caspase-3 mRNA 表達增加（P＜0.05）（見圖1F 和表2）。

圖1 鹽酸小檗堿促進HSC-LX2 細胞凋亡

2.2 鹽酸小檗堿抑制HSCs 自噬

4 組Beclin1、Atg5 mRNA 和蛋白表達比較，差異 有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組與溶劑對照組比較，Beclin1、Atg5 mRNA及蛋白表達均有下降（P＜0.05）。見圖2A、B 和表3。

表2 各組HSCs 凋亡率、Caspase-3 陽性細胞熒光強度、Caspase-3 蛋白活性和Caspase-3 mRNA 比較（±s）

表2 各組HSCs 凋亡率、Caspase-3 陽性細胞熒光強度、Caspase-3 蛋白活性和Caspase-3 mRNA 比較（±s）

注：?溶劑與對照組比較，P＜0.05。

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2.3 鹽酸小檗堿抑制HSCs Akt 信號通路

4 組Akt mRNA 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組與溶劑對照組比較，HSC-LX2 細胞Akt mRNA 表達下降（見表3）。鹽酸小檗堿10 和20μg/ml 組與溶劑對照組比較，各組均干預24h，Akt 蛋白水平均下降。鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組與溶劑對照組比較，各組均干預24h，Akt蛋白磷酸化水平及p-Akt/Akt 均下降（P＜0.05）。見圖3A、B。

2.4 鹽酸小檗堿抑制HSCs JNK 信號通路

4組JNK mRNA比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與溶劑對照組比較，鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml組JNK mRNA 的表達水平下降（見表3 和圖4A）。Western blotting 檢測結果顯示，與溶劑對照組比較，鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組p-JNK 和JNK 蛋白水平均下降（P＜0.05）。p-JNK/JNK 蛋白表達各組下降，但與溶劑對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4A、B。

圖2 鹽酸小檗堿抑制HSC-LX2 細胞的Beclin1、Atg5 mRNA 及蛋白的表達

表3 4 組Beclin1、Atg5、Akt 及JNK mRNA 的相對表達（±s）

表3 4 組Beclin1、Atg5、Akt 及JNK mRNA 的相對表達（±s）

注：?與溶劑對照組比較，P＜0.05。

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圖3 鹽酸小檗堿抑制HSC-LX2 細胞Akt mRNA 及蛋白表達

圖4 鹽酸小檗堿抑制HSC-LX2 細胞JNK mRNA 及蛋白表達

3 討論

研究發現，鹽酸小檗堿抑制人類口腔鱗狀細胞癌HSC-3 細胞的增殖并增加其凋亡[13]。本研究發現鹽酸小檗堿促進HSCs 的凋亡，流式細胞儀分析鹽酸 小檗堿干預HSC-LX2 后細胞的凋亡率，與溶劑對照組比較，鹽酸小檗堿5、10 和20μg/ml 組HSC-LX2細胞凋亡率增加，鹽酸小檗堿促進HSC-LX2 的凋亡隨著濃度的升高而逐漸增強，在20μg/ml 作用最明顯。Caspase 是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，凋亡誘導信號作用Caspases，繼而水解細胞內的靶物質，細胞內蛋白降解，使細胞走向凋亡[14]。Caspase-3在細胞凋亡過程中占據核心地位。本研究發現，鹽酸小檗堿促進Caspase-3 mRNA 表達，增加Caspase-3陽性細胞熒光強度及蛋白活性，這說明HSCs 在凋亡過程中激活Caspase-3，Caspase-3 參與鹽酸小檗堿促進HSCs 凋亡的過程。LU 等[15]研究發現，鹽酸小檗堿促進結腸癌細胞凋亡，其在促進凋亡過程中增加Caspase-3 的表達及活性，與本研究一致。

磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/Akt 是一種調節細胞增殖、凋亡和細胞周期的信號通路。為進一步研究鹽酸小檗堿促進HSCs 的凋亡機制，qRT-PCR 和Western blotting 檢測Akt mRNA 及Akt、p-Akt 蛋白水平。鹽酸小檗堿抑制HSC-LX2 細胞的Akt mRNA 及Akt、p-Akt蛋白的表達，而且這種抑制所用隨著鹽酸小檗堿濃度的升高而增強。Akt 的磷酸化在調節細胞凋亡的過程中作用關鍵，鹽酸小檗堿在降低Akt mRNA 及蛋白表達的同時，抑制Akt 的磷酸化。說明鹽酸小檗堿通過調節Akt 信號通路促進HSCs 的凋亡。YI 等[16]發現，在人類胃癌細胞中，鹽酸小檗堿可以促進其凋亡，其機制通過抑制Akt 磷酸化，即使激活Akt 的情況下，鹽酸小檗堿也可以抑制Akt 磷酸化。與本研究結果一致。

自噬是通過降解細胞內長壽命蛋白和破損的細胞器，保持細胞內環境穩定，實現某些細胞器的更新[5]。 抑制HSCs 自噬后能明顯抑制HSCs 活化，并對脂滴具有一定的保護作用。本研究發現在鹽酸小檗堿5、10 和20 μg/ml 組HSC-LX2 細胞與溶劑對照組比較，Beclin1、Atg5 mRNA 及蛋白均有下降。Beclin1 可調控自噬前體的形成，Atg5 在自噬體形成過程中起重要作用。通過敲除自噬必須基因Atg7或Atg5的方法，或通過3-MA 或氯喹等自噬抑制劑干預細胞，抑制自噬，可以抑制肝肺等不同的組織和細胞纖維化進程，自噬可以抑制肝纖維化[17-18]。說明鹽酸小檗堿可以抑制HSCs 自噬，進一步推斷，鹽酸小檗堿可以抑制肝纖維化。為進一步研究鹽酸小檗堿抑制HSCs 自噬的機制，應用qRT-PCR 檢測JNK mRNA 的表達，Western blotting 檢測p-JNK、JNK 蛋白表達，結果顯示，鹽酸小檗堿抑制JNK mRNA 及蛋白的表達，也抑制JNK 蛋白磷酸化。ZHOU 等[19]研究發現，JNK 信號通路是調節細胞凋亡的重要信號通路，有研究發現活化JNK 信號傳導途徑可以促進HSCs 自噬的發生[8]。可見鹽酸小檗堿通過抑制JNK 的表達及JNK 蛋白的磷酸化，抑制HSCs 的自噬。

鹽酸小檗堿促進HSCs 凋亡并抑制其自噬，其通過抑制Akt 信號通路促進凋亡，通過抑制JNK 信號傳導途徑抑制自噬。