白細胞介素-37在類風濕關節炎患者外周血單個核細胞中的表達及意義*

柯慶喜，黃 震，余紅嵐，陳思達，束振華，武紅梅

(1.貴陽市第一人民醫院檢驗科，貴州貴陽 550001；深圳市龍崗中心醫院:2.檢驗科；3.內分泌科，廣東深圳 518116)

類風濕關節炎(RA)是以累積周圍關節為主的慢性炎癥性自身免疫病，表現為滑膜襯里細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤，以及血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[1]。RA的發病機制尚不完全清楚，現有的研究證實炎性細胞因子網絡在RA的滑膜炎癥中起著關鍵作用，RA滑膜組織產生的細胞因子網絡，是引起炎癥反應、蛋白水解、細胞募集和增殖的重要介質。白細胞介素(IL)-37是一種抗炎細胞因子，目前研究發現IL-37在多種疾病中起到保護作用，特別是對系統性紅斑狼瘡[2]、克羅恩病[3]、病態肥胖[3]等自身免疫性疾病以及脂多糖(LPS)誘導的感染性休克方面具有明顯的抗炎保護作用。活動性RA患者滑膜內層高表達IL-37，而在健康人群中卻不表達[4]。IL-37作為抑炎性因子，可能通過介導一種負反饋機制來抑制炎癥，這提示IL-37參與了RA的發病進程。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1對照組 收集2018年1-8月在貴陽市第一人民醫院體檢中心體檢的30例健康標本，其中男13例，女17例，年齡23～68歲，平均(34.4±6.2)歲，經檢查無急慢性病史、無遺傳病家族史、無自身免疫性疾病。

1.1.2疾病組 收集2018年1-8月在貴陽市第一人民醫院就診的RA患者60例。診斷符合2010年美國風濕病學會(ACR)/歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)RA評分標準[5]。排除重度感染、嚴重心腦血管病、肝腎疾病、惡性腫瘤、活動性結核病。并根據臨床資料計算類風濕性關節炎疾病活動性評分(DAS)，將其分為活動期RA患者30例，其中男8例，女22例，年齡20～72歲，平均(47.32±13.21)歲，穩定期RA患者30例，其中男12例，女18例，年齡26～76歲，平均(48.41±14.68)歲。本研究經貴陽市第一人民醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-37水平 采集患者清晨空腹靜脈血3 mL。離心后取上清，置于-20 ℃保存待測。全部標本一次性檢測。血清IL-37測定采用ELISA，試劑盒購自武漢華美生物公司。操作嚴格按照說明書進行。

1.2.2實時熒光定量 PCR檢測 提取患者外周血單個核細胞(PBMC)，采用Trizol法提取總RNA。按寶生物Prime Script RT Master Mix試劑盒說明進行cDNA合成。IL-37基因特異性引物(根據GENBank 登錄號NM_014439的IL-37的基因序列設計)及看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由廣州英駿公司合成，引物序列見表1。采用SYBR Green實時熒光定量檢測技術進行目的基因的檢測，按照寶生物公司SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明在ABI Prism 7500 型熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司)進行定量檢測。反應體系為20 μL。取樣本總cDNA總量2 μL，10 μmol/L。上下游引物各0.8 μL，加入試劑盒其他成分。PCR反應條件：預變性95 ℃ 30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。每組實驗重復3次。根據熔解曲線控制每個樣品的擴增特異性。每一個樣品目的基因擴增的循環數(Ct)都依據GAPDH進行校正，得出ΔCt(Ct目的基因-CtGAPDH)。目標基因表達差異以疾病組相對于對照組的倍數表示，即檢測基因的差異為2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt疾病組-ΔCt對照組)。

1.2.3類風濕因子(RF)和抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體檢測 血清RF的檢測，采用日立7600全自動生化儀及配套試劑，運用免疫透射比濁法，嚴格按照儀器操作手冊測定，血清中抗CCP抗體采用羅氏電化學發光免疫分析儀及配套試劑測定。

2 結 果

2.1RA患者PBMC中IL-37 mRNA的表達檢測 以對照組細胞作為空白組樣品，計算出各個實驗組樣品相對于空白組樣品的基因相對表達量(2-ΔΔCt)。活動期RA患者組PBMC IL-37 mRNA的相對表達量與穩定期RA患者組PBMC IL-37 mRNA的相對表達量分別是對照組的3.35倍和2.19倍，差異有統計學意義(P<0.05)。而活動期RA患者組IL-37 mRNA相對表達量與穩定期RA患者組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

表1 IL-37引物序列表

注：與對照組比較，*P<0.05；與穩定期組比較，#P<0.05。

圖1不同組別RA患者PBMC IL-37mRNA相對表達量

2.2血清IL-37 ELISA檢測結果 根據直線回歸方程式代入各樣本吸光度值，計算出所有樣本的IL-37濃度，結果顯示RA患者血清IL-37水平明顯高于對照組[(71.27±23.56)pg/mLvs. (17.13±5.64)pg/mL]，差異有統計學意義(t=17.81,P=0.000)。通過臨床資料分析，進一步將RA患者分為活動期組與穩定期組，結果顯示與穩定期RA患者[(55.13±13.55)pg/mL]比較，活動期RA患者血清IL-37的水平[(87.41±19.68)pg/mL]明顯增高，差異有統計學意義(t=8.99,P=0.000)。

表2 不同組別RA患者血清IL-37水平與病情診斷評分相關性分析

2.3RA患者血清抗CCP抗體、RF水平與IL-37水平相關性分析 RA患者血清IL-37水平與抗CCP抗體、RF抗體的水平呈正相關(r=0.468，P=0.001；r=0.384，P=0.004)，見圖2、3。

2.4IL-37血清水平與RA診斷評分相關性 活動期組與穩定期組血清IL-37水平與RA患者病情診斷評分均呈正相關(P<0.05),見表2。

圖2 RA患者血清IL-37水平與抗CCP抗體的相關性

圖3 RA患者血清IL-37水平與RF的相關性

3 討 論

RA是以累及周圍關節為主的多系統炎癥性的自身免疫病。RA的發病機制尚不完全清楚，現有的研究證實，炎性細胞因子網絡在RA的滑膜炎癥中起著關鍵作用，RA患者滑膜組織中存在著大量CD4+T的Th1細胞，它所產生的IL-1α、IL-1β和IL-18等細胞因子，具有很強的促炎作用[6]。IL-18能夠活化單核/巨噬細胞，誘導干擾素-γ(IFN-γ)產生，導致RA炎癥反應加重。研究表明IL-37能與IL-18BP和IL-18Rα的Fc段結合形成三元絡合物，抑制IL-18的信號傳導通路，促使細胞核因子κB不發生移位，減少了IFN-γ的合成[7-8]，提示IL-37可通過抑制IFN-γ的合成來減輕RA炎癥反應。IL-37通過抑制樹突狀細胞活性來實現其抗炎作用[9]。DCs可激活RA滑膜的自身反應性T細胞,導致炎癥的持續存在。本實驗研究表明RA患者中IL-37水平增加，使其可以抑制樹突狀細胞活性，減輕DCs引起的固有免疫應答反應。IL-37與Smad3相結合發揮炎癥抑制效應，研究證實Smad3參與了IL-37胞內信號轉導[10]。Smad3可與TGF-β結合使Smad3磷酸化，并轉移至胞核內影響基因轉錄，IL-37可部分通過Smad3行使其功能，促進TGF-β細胞因子抑制屬性，從而發揮其抗炎功效。

研究對收集的RA患者病例，依據類風濕性關節炎疾病活動性評分標準，將其分為活動期組和穩定期組。應用實時熒光定量PCR檢測RA患者PBMC IL-37 mRNA的表達，發現RA患者組的IL-37 mRNA表達量明顯高于對照組，并且活動期組的上調量高于穩定期組，兩組比較差異有統計學意義，提示IL-37在RA的發病過程中發揮了作用，可能參與了RA的炎癥反應調節。現有的研究證實炎癥因子能夠上調人滑膜細胞IL-37的表達[11]。本研究應用ELISA法檢測了RA患者血清IL-37水平，結果顯示，RA患者血清IL-37水平顯著高于對照組。活動期組IL-37水平明顯高于穩定期組。進一步分析IL-37水平與RA臨床指標相關性，結果表明RA患者IL-37水平與RF、抗CCP抗體水平有顯著相關性，患者RA疾病診斷評分與血清IL-37水平有顯著相關性，提示IL-37與RA患者嚴重程度呈正相關。RF和抗CCP抗體作為RA特異性診斷和判斷預后的重要指標；其高滴度的抗體水平常提示患者病情較重，進展快，骨破壞嚴重，這提示IL-37水平與RA的病情嚴重程度具有一定相關性，IL-37可作為評估病情嚴重程度的指標而進一步指導臨床診治。

綜上所述，RA患者中IL-37水平顯著增加，并且活動期患者IL-37水平明顯高于穩定期患者，表明IL-37參與了RA的發病過程。RA患者血清IL-37水平與RF、抗CCP抗體等RA自身抗體呈正相關，提示IL-37可作為評估病情嚴重程度的指標。IL-37是一種抗炎因子[12]，在RA發病機制中有重要作用，在RNA的病情判斷中有潛在應用價值，但由于本試驗樣本量較少，試驗人群范圍有限，還需進一步研究與探討。