臨床分離碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌株的血清莢膜分型及耐藥機制

嚴 宏，嚴 華

(武漢市第三醫院光谷院區：1.檢驗科；2急診科，湖北武漢 430073)

肺炎克雷伯菌(KP)是臨床主要的條件致病菌之一，主要引起醫院獲得性肺炎及血流感染性疾病，尤其在新生兒、老年人、腫瘤患者等免疫力低下人群，或長期使用抗菌藥物人群中易感[1-2]。碳青霉烯類抗菌藥物因其抗菌譜廣，穩定性較好等優點而被用為治療臨床感染的首選藥物[3]。但隨著該類抗菌藥物頻繁使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)逐漸增多。研究發現部分KP可產生莢膜，形成高黏液表型，具有高毒力，高耐藥率等特點[4]。莢膜是KP重要的毒力因子，其種類多變，主要由酸性脂多糖組成，與病原菌的毒力有關。薛娟等[5]研究結果顯示，感染CRKP患者較其他病原菌感染患者病死率顯著增加。因此，對本院分離的CRKP菌株血清莢膜進行分型，研究其具體耐藥機制，有利于對CRKP感染患者進行針對性用藥，減少患者病死率。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2016年2月至2018年2月本院各種臨床標本(血液、尿液、痰液、腹腔引流液等)，排除同一患者同一部位重復標本，共獲取KP 316例，其中CRKP 126株，男性患者80例(5例患者從不同部位分離到菌株)，女性患者38例(3例患者從不同部位分離到菌株)；痰液中分離菌株82株，血液中分離24株，尿液中分離7株，腹腔引流液中分離13株。質控菌包括大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。本研究所有菌株均采用Vitek2-Compact全自動微生物鑒定儀進行鑒定。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 主要包括Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀及配套藥敏卡、細菌濁度儀、凝膠成像系統、PCR儀、ABI-PRISM 3730測序儀、DYC-6C電泳儀。PCR反應試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定及藥敏試驗 本研究采用Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀對分離菌株進行體外藥物敏感試驗，參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)規定標準[6]，美國食品藥品監督管理局(FDA)標準[7]判讀替加環素敏感性，進一步確定CRKP和不耐藥的KPN(non-CRKP)。

1.3.2黏液絲試驗 將菌種接種于血瓊脂平板，35 ℃培養過夜，以接種環輕輕挑起菌落后，黏液絲長度≥5 mm為試驗陽性，重復三次以上均陽性者為黏液菌株。

1.3.3碳青霉烯酶表型檢測 (1)改良Hodge試驗：將配制好的0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC 25922菌液稀釋，將菌液均勻涂布于MH平板，3～5 min后，在培養基中央放置美羅培南紙片，挑選3～5個待測菌種純菌落垂直于紙片，自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，以ATCC BAA-1705為陽性對照，ATCC BAA-1706為陰性對照，35 ℃培養孵育16～18 h。評價標準：待測菌株與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交界處出現向內增強生長，抑菌圈不規則，表明該待測菌種為碳青霉烯酶菌株。(2)碳青霉烯酶抑制試驗(CIM)：以ATCC BAA-1705為陽性對照，ATCC BAA-1706為陰性對照，將待測菌種混入1.5 mL無菌雙蒸水內，加入亞胺培南紙片(10 μg)，35 ℃培養孵育4 h，將配制好的0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC 25922菌液稀釋，將菌液均勻涂布于MH平板培養基，取出孵育好的紙片貼于MH平板，35 ℃培養過夜，觀察結果。結果評價標準：大腸埃希菌ATCC 25922生長不受抑制，為產碳青霉烯酶菌株；大腸埃希菌ATCC 25922生長受抑制，為不產碳青霉烯酶菌株。

1.3.4PCR檢測血清莢膜、耐藥基因及高毒力基因 利用PCR法檢測擴增菌株K1、K2、K5、K20、K54、K57等常見莢膜基因型，常見碳青霉烯酶耐藥基因KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48，β-內酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M，膜孔蛋白基因Ompk35、Ompk36，AmpC酶基因DHA，常見毒力基因magA、rmpA、rmpA2、aerobactin、wcaG、mrkD、iroN、allS，引物、反應體系及反應條件參考文獻[8],序列見表1。

續表1 擴增基因的引物序列

注：F代表上游引物；R代表下游引物。

2 結 果

2.1藥敏檢測結果 本研究共分離出CRKP 126株，占39.87%。126株CRKP菌株中，對頭孢菌素類、酶抑制劑類、碳青霉烯類、單環類藥物耐藥率最高，顯著高于non-CRKP菌株(P<0.05)，替加環素類耐藥率最低，與non-CRKP菌株差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2碳青霉烯酶表型檢測結果 改良Hodge試驗陽性106株，陽性率33.54%；CIM試驗陽性117株，陽性率37.03%。見圖1。

2.3血清莢膜分型及毒力基因 12株CRKP為黏液絲試驗陽性，均未檢測到K1、K2、K5、K20、K54、K57血清型。所有CRKP中，檢測出K1血清型10株，均攜帶黏液表型調控基因rmpA基因，K2、K5、K20、K54、K57血清型均未檢測到，尚未分型116株。126株CRKP均檢測到毒力基因fimH基因，比例最高(100%)，見表3。

表2 藥敏試驗結果的比較[n(%)]

續表2 藥敏試驗結果的比較[n(%)]

注：A表示改良Hode試驗，B表示CIM試陽。圖A中，1為ATCC1705，2為ATCC1706，3為陽性菌株；圖B中，1為ATCC1706，2為陽性菌株，3為ATCC1705。

圖1碳青霉烯酶表型檢測

表3 毒力基因的分布

2.4耐藥基因及膜孔蛋白檢測結果 126株CRKP中，檢測出A類碳青霉烯酶KPC基因117株，NDM基因6株，IMP基因3株；β-內酰胺酶基因TEM基因53株，SHV基因100株，CTX-M基因112株，膜孔蛋白Ompk35基因缺失50株，Ompk36基因缺失94株，其中，缺失Ompk35膜孔蛋白基因的菌種均同時缺失Ompk36基因。見表4。

2.5CRKP攜帶耐藥基因情況 CRKP中攜帶4種不同耐藥基因的菌株數目最多，共64株，攜帶6種及不攜帶耐藥基因的菌株數目最少，僅有1株。見表5。

表4 耐藥基因及膜孔蛋白檢測結果

表5 CRKP攜帶耐藥基因情況

3 討 論

KP作為臨床重要的條件致病菌之一，近年來，研究顯示，其對主要的抗菌碳青霉烯類藥物耐藥率不斷上升，CRKP比例不斷上升，部分地區有暴發流行趨勢。已有研究表明，CRKP感染患者病死率顯著增加[5]。CRKP引起患者死亡主要與其多重耐藥、毒力表達有關[9]。目前研究結果顯示，CRKP主要耐藥機制為菌體產生碳青霉烯酶，可水解抗菌藥物[10]。此外，還有研究報道，其耐藥性可能與AmpC酶合并外膜孔蛋白通透性改變有關[11]。本研究從本院患者臨床標本中分離出CRKP 126株，占39.87%，其中對頭孢菌素類、酶抑制劑類、碳青霉烯類、單環類藥物耐藥率最高，顯著高于non-CRKP菌株，替加環素類耐藥率最低，與non-CRKP菌株差異無統計學意義，表明CRKP對多類抗菌藥物耐藥，本研究結果提示，臨床可對CRKP使用替加環素治療。

莢膜作為KP重要的毒力因子，主要由酸性脂多糖組成，其中甘露糖與莢膜毒力有關，研究顯示，高毒力KP可產生大量莢膜多糖，莢膜呈高黏液表型，是重要的致病因素[12]。本研究通過黏液絲試驗表明，分離得到的126株CRKP中，共有12株為高黏液絲菌株。根據K抗原分型，目前莢膜有80多種血清分型，常見的主要是K1、K2、K5、K20、K54、K57。以往研究表明，K抗原在高黏液性毒力KP上檢出率高達85%[13]，在本研究檢出的12株高黏液菌株中，均未檢測到K抗原，與馮曉靜等[12]研究結果不符，推測原因可能為該12株菌株表達為其他未檢測莢膜分型，或是獲得耐藥性后莢膜基因表達減弱。126株 CRKP中，檢測出K1血清型10株，均攜帶黏液表型調控基因rmpA基因，但均未表現出高黏液表型，目前關于rmpA基因與高黏液表型的關系仍未得到闡明，具體原因有待進一步研究分析。在本研究中，各種毒力基因均有不同程度表達，毒力基因fimH基因比例最高。陳妍妍等[14]報道發現，菌毛黏附在細菌感染中發揮重要作用，fimH基因是介導Ⅰ型菌毛的基因，與王歡歡等[15]報道KP中普遍存在Ⅰ型菌毛一致，提示fimH基因是CRKP中重要的毒力基因。

碳青霉烯酶主要分為A、B、D類，A類酶主要包括KPC、SME、NMC、IMI、GES等基因，B類酶又稱為β-內酰胺酶，包括IMP、VIM、NDM、SIM、GIM等基因。KPC作為我國目前流行的A類碳青霉烯酶，可水解大多數青霉素類、頭孢素類抗菌藥物。本研究采用改良Hodge試驗及CIM試驗檢測菌株碳青霉烯酶表型，結果顯示改良Hodge試驗陽性106株，CIM試驗陽性117株，其中CIM試驗檢測結果與PCR結果一致，推測可能是由于部分菌株產碳青霉烯酶量較少，致使結果判斷出現假陰性。PCR結果表明，檢測出A類碳青霉烯酶KPC基因117株，NDM基因6株，IMP基因3株；β-內酰胺酶基因TEM基因53株，SHV基因100株，CTX-M基因112株，膜孔蛋白Ompk35基因缺失50株，Ompk36基因缺失94株，其中，缺失Ompk35膜孔蛋白基因的菌種均同時缺失Ompk36基因，提示本院分離到的126株CRKP中，主要耐藥機制為產碳青霉烯酶，同時合并有部分菌株膜孔蛋白通透性改變。本研究統計分析發現，分離獲得的126株CRKP中，以攜帶4種不同耐藥基因的菌株數目最多，提示在臨床工作中要采用不同方法對菌株的耐藥機制進行檢測，選擇合適藥物進行治療。

4 結 論

本研究分離獲得的CRKP主要耐藥機制為產碳青霉烯酶，部分菌株合并有膜孔蛋白基因缺失，但關于CRKP莢膜血清分型尚不清楚，將進一步進行探究。