核酸實(shí)驗(yàn)室混樣篩查檢測(cè)過程的拆分陽(yáng)性率分析*

張 麗，孫國(guó)棟

(邯鄲市中心血站,河北邯鄲 056001)

血站實(shí)驗(yàn)室的血液篩查工作是保證臨床輸血安全有效的重要屏障。雖然現(xiàn)階段在酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝表面抗原(HBsAg)、HCV抗體(抗-HCV)、HIV抗體(抗-HIV)性能上有很大程度提高，但對(duì)于病毒窗口期、靜默感染等[1]卻是無(wú)法檢出，而核酸檢測(cè)技術(shù)具有高度敏感性和特異性，有利于隱匿性感染的檢出,有利于縮短病毒檢測(cè)窗口期。核酸檢測(cè)抗干擾能力弱，對(duì)設(shè)備及環(huán)境、人員等要求高，核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理就顯得尤為重要[2]。本中心血站自2018年起參與了京津冀血液篩查實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量指標(biāo)監(jiān)控，為提高本站血液篩查能力提供了優(yōu)質(zhì)的學(xué)習(xí)資源和平臺(tái)。筆者以此為契機(jī)通過對(duì)拆分陽(yáng)性率的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)與回顧性分析，從這一角度客觀評(píng)價(jià)檢測(cè)過程的運(yùn)行狀況，目的在于發(fā)現(xiàn)問題所在，以便在工作中尋找相應(yīng)解決方案。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取2016年1月至2018年12月河北邯鄲地區(qū)18～55歲的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本共274 309份。采集獻(xiàn)血者靜脈血標(biāo)本共2管，使用乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝的負(fù)壓真空管留取標(biāo)本,其中1管為8 mL(有分離膠)用于核酸檢測(cè)，另外1管5 mL(無(wú)分離膠)用于血清學(xué)檢測(cè)。核酸管采血后，需要在4 h內(nèi)離心,置于2～8 ℃冰箱保存,各檢測(cè)需在72 h內(nèi)完成。

1.2儀器與試劑 核酸檢測(cè)試劑為華益美核酸檢測(cè)試劑盒；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)使用的試劑為上海科華、北京萬(wàn)泰、珠海麗珠、廈門新創(chuàng)公司的產(chǎn)品。以上試劑均批檢合格,不同批號(hào)試劑均在有效期內(nèi)使用。儀器包括FAME2430全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)、ABI7500擴(kuò)增儀、尤瑞納斯AE280全自動(dòng)酶免一體機(jī)、Hamiltom Star全自動(dòng)加樣儀和全自動(dòng)核酸提取儀。各實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照《血站技術(shù)操作規(guī)程》和試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)此研究分時(shí)間、分試劑批號(hào)的陽(yáng)性檢出率、拆分陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組陽(yáng)性率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1核酸檢測(cè)情況 共檢測(cè)核酸標(biāo)本274 309份,一部分為其中一種試劑檢測(cè)反應(yīng)性判為待查的標(biāo)本；另一部分為經(jīng)過ELISA檢測(cè)后2個(gè)試劑廠家均為陰性的標(biāo)本。其中混樣反應(yīng)率0.12%(335/274 309)，拆分陽(yáng)性數(shù)152例,拆分陽(yáng)性率為45.97%。2016至2018年拆分陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.16，P<0.05)。見表1。

2.22018年1-12月拆分情況匯總 由表2可見，2018年全年混檢陽(yáng)性pool數(shù)為135，拆分陽(yáng)性pool數(shù)為70，拆分陽(yáng)性率為51.85%(70/135)。1-12月拆分陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2016～2018年核酸檢測(cè)情況匯總

表2 2018年1-12月拆分情況匯總

注：1-12月拆分陽(yáng)性率比較,χ2=63.61，P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

《血站實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范》規(guī)定，血站實(shí)驗(yàn)室必須建立和持續(xù)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系，并負(fù)責(zé)組織實(shí)施和嚴(yán)格監(jiān)控[4]。通過對(duì)核酸檢測(cè)拆分陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)，可以有效評(píng)估整個(gè)核酸檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以及所使用的核酸試劑的性能。

2016年1月至2018年12月本站共檢測(cè)核酸標(biāo)本274 309份,其中混檢反應(yīng)率為0.12%,與北京0.14%[5]、寶雞0.15%[6]等地相比略低。拆分陽(yáng)性152例,拆分陽(yáng)性率為45.97%,低于臨近的唐山地區(qū)79.45%[7]、安陽(yáng)地區(qū)75.00%[8]；徐州地區(qū)63.3%[9],渭南地區(qū)的61.11%[10]。陽(yáng)性檢出率為0.55‰,與大連0.50‰[11]相似,低于國(guó)內(nèi)一些城市[12-14]。原因可能與以下因素相關(guān)：(1)使用單人份HBV DNA試劑靈敏度高于混樣核酸檢測(cè);(2)由于核酸檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)原理不同,系統(tǒng)設(shè)計(jì)不同,操作流程各有差異,導(dǎo)致病毒檢出率有所不同；(3)人群分布的地域差異導(dǎo)致病毒檢出率的差異； 2015年底本站開展核酸檢測(cè)以來，標(biāo)本數(shù)量逐年上升，拆分陽(yáng)性率也相應(yīng)提高，2016年與2017年基本持平，2018年則提高較多原因可能有以下三點(diǎn)：(1)在開展核酸檢測(cè)初期，操作人員對(duì)設(shè)備的使用缺乏經(jīng)驗(yàn)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)一定波動(dòng)；(2)本單位所使用的試劑在抗污染方面有待提高；(3)2018年本單位參加京津冀血液篩查實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量分析，按照要求又對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行進(jìn)一步的嚴(yán)格把控，不斷提高實(shí)驗(yàn)的有效拆分。而前兩點(diǎn)在2018年也有了較大改善，故2018年的拆分陽(yáng)性率同比增長(zhǎng)約15%。本核酸實(shí)驗(yàn)室拆分陽(yáng)性率也高于在2018年京津冀血液篩查實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量指標(biāo)數(shù)據(jù)匯總分析中的拆分陽(yáng)性率均線48.94%。

在2018年拆分的70例陽(yáng)性中有1例標(biāo)本,第1次拆分檢測(cè)陰性,但有線下起跳的現(xiàn)象,根據(jù)本站核酸檢測(cè)操作規(guī)程,結(jié)合擴(kuò)增曲線特征,為此進(jìn)行第2次拆分結(jié)果為陽(yáng)性,且循環(huán)閾值(Ct)值范圍為>39～43。這與趙欣等[15]的報(bào)道相似。而在之前本核酸實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)過Ct值在此范圍里的標(biāo)本拆分陽(yáng)性率有42.86%,這提示在未被拆分出的標(biāo)本中可能存在以下原因：(1)標(biāo)本混檢陽(yáng)性為假陽(yáng)性結(jié)果，雖然核酸檢測(cè)靈敏度較高，但檢測(cè)中存在一定的不確定度，對(duì)人員操作，環(huán)境控制，抗污染能力要求較高[16]，容易造成非特異性擴(kuò)增。(2)如果病毒的濃度處于試劑盒檢測(cè)限以下或極低水平,由于病毒顆粒在血漿中泊松分布,吸樣時(shí)未必能每次都吸取到含有一定量病毒的樣本,從而影響檢出,造成假陰性；(3)不合適的保存溫度、不規(guī)范的運(yùn)送條件、其他干擾物的存在都可能導(dǎo)致病毒降解造成假陰性的產(chǎn)生。

美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLSI-GP35D關(guān)于監(jiān)控指標(biāo)的文件里[17]，明確了混檢陽(yáng)性率是混檢陽(yáng)性標(biāo)本個(gè)數(shù)與檢測(cè)標(biāo)本個(gè)數(shù)之比，若混檢陽(yáng)性率出現(xiàn)升高，應(yīng)觀察拆分陽(yáng)性率，若拆分陽(yáng)性率呈現(xiàn)下降，提示該實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)過程中存在污染的風(fēng)險(xiǎn)有所增加。此時(shí)應(yīng)該排查可能導(dǎo)致污染的步驟，并對(duì)可能導(dǎo)致污染的因素進(jìn)行評(píng)估[18]。本實(shí)驗(yàn)室每月月初對(duì)上一月核酸檢測(cè)情況進(jìn)行回顧性總結(jié)與分析，當(dāng)分析發(fā)現(xiàn)拆分陽(yáng)性率下降的情況出現(xiàn)時(shí)，首先會(huì)對(duì)操作環(huán)節(jié)進(jìn)行加強(qiáng)培訓(xùn)，例如操作人員的再培訓(xùn)，室內(nèi)溫濕度控制，操作時(shí)防污染控制，調(diào)整試驗(yàn)完畢后的消毒措施；其次分析檢測(cè)系統(tǒng)本身的原因，例如在人員、環(huán)境、操作步驟都相對(duì)固定的情況下，若某批次試劑在使用過程中出現(xiàn)拆分陽(yáng)性率雖然在平均水平，但檢出率卻明顯超出平均水平的情況，需將此批號(hào)所檢出的陽(yáng)性標(biāo)本均留樣并送衛(wèi)健委臨檢中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證，待結(jié)果回報(bào)后再進(jìn)行分析總結(jié)。

綜上所述，現(xiàn)行的監(jiān)控指標(biāo)可以有效地監(jiān)控并保障每批次試驗(yàn)正常運(yùn)行。血站血篩實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行狀況直接關(guān)系到血液安全，應(yīng)通過從“人、機(jī)、料、法、環(huán)”等方面查找漏洞，及時(shí)發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)量的不穩(wěn)定因素并采取措施，使血站血篩實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)控不斷完善。