胃癌組織中miR-133a-3p、miR-4317的表達及臨床意義

楊建華，牛廣旭，郭曉娟，王 靜

(河北省邯鄲市中心醫院病理科，河北邯鄲 056001)

胃癌是人類最常見的癌癥類型之一，是僅次于肺癌的第二大腫瘤死亡原因，每年新增胃癌患者達93.4萬例[1]，我國胃癌致死病例占全世界胃癌致死總數的40%左右[2]。不同胃癌患者的早期癥狀各不相同[3]，胃癌常在晚期診斷，伴有惡性增生和轉移[4]。盡管目前胃癌的化療和分子靶向治療取得了進展，但對晚期胃癌患者的預后仍然不利，胃癌的5年生存率低于25%[5-6]。因此，尋找一種能夠在早期預測和術后預警胃癌患者生存的檢測指標具有重要的臨床意義。微小RNA(miR)是一種長度為19～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA，它參與人類近1/3基因的表達調控，在發育時序的控制、細胞周期調控、細胞凋亡等方面發揮著重要的作用[7]。miR-133a在食管癌[8]、膀胱癌[9]、結直腸癌[10]等多種腫瘤中存在異常表達，并在腫瘤的侵襲、轉移、增殖、凋亡及藥物耐藥方面發揮重要的調節作用。有研究發現，miR-133a在胃癌中表達也存在顯著異常，并抑制胃癌的發生、發展[11]；miR-133a-3p在胃癌的發生和發展過程中發揮重要作用，有研究報道miR-133a-3p能夠抑制胃癌細胞SGC7901的增殖和遷移[12]。miR-4317位于18p 11.31，是一種新發現的miR，在黑色素瘤[13]和非小細胞肺癌[14]等多種腫瘤中均有異常表達。miR-133a-3p和miR-4317在胃癌患者中均表現為異常表達，并且二者與胃癌的發生和發展有著密切的關系，然而目前臨床上關于胃癌中miR-133a-3p和miR-4317的研究以及二者與胃癌患者的臨床特征間的關系研究較少。因此本研究主要通過分析miR-133a-3p和miR-4317在胃癌組織表達水平，探討二者與胃癌患者的預后、臨床特征的關系，為胃癌的預測和預后判定提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年4月到2012年3月入住本院的60例胃癌患者的胃癌組織標本(非壞死部分)及其相應的癌旁正常組織標本(距離≥5 cm癌旁正常組織)。納入標準：病理學診斷為胃癌，采用手術切除(根治術或姑息性手術)，患者術前未進行任何放療和輔助治療，臨床資料及隨訪資料完整，簽署知情同意書；排除標準：合并其他惡性腫瘤，術前已接受抗腫瘤治療者，患全身感染性疾病、肝腎疾病者。本研究60例胃癌患者年齡21～75歲，<60歲患者33例，≥60歲患者27例；男性患者45例，女性患者15例；低分化患者28例，中高分化患者32例；淋巴結轉移患者35例，無淋巴結轉移患者25例；浸潤深度：黏膜下各層23例，漿膜層37例；有遠處轉移44例，無遠處轉移16例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期34例。本研究經醫院倫理委員會審核同意。

1.2方法

1.2.1組織RNA提取及實時熒光定量反轉錄PCR(RT-qPCR)試驗 Trizol試劑(Takara公司)提取來自組織中的總RNA。反轉錄試劑盒(Takara公司)對mRNA進行反轉錄。RT-qPCR使用試劑盒SYBR Green PCR Kit(Takara公司)。反應條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共45個循環。U6引物為miR-4317和miR-133a-3p內源性對照。所用特異性引物序列如下：miR-133a-3p正向引物為5′-CGA GCC TTT GGT CCC CTT CAA C-3′，miR-133a-3p反向引物為5′-TCA ACT GCT GGT GTC GTG GAG TCG GC-3′；miR-4317正向引物為5′-ATC CAG TGC GTG TCG TG-3′，miR-4317反向引物為5′-TGC GT C ACA TTG CCA GG-3′；U6正向引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.2隨訪 采用電話或者門診復查的方式對患者進行隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪時間為確診后1～60個月，直至患者死亡或者截止隨訪時間。

2 結 果

2.1不同胃組織中miR-133a-3p與miR-4317的表達 RT-qPCR試驗結果顯示，胃癌組織中miR-133a-3p、miR-4317相對表達量均低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-133a-3p、miR-4317在不同胃組織中相對表達量比較

2.2胃癌組織中miR-133a-3p與miR-4317表達與患者臨床特征的關系 胃癌組織中miR-133a-3p表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、分化程度、浸潤深度、遠處轉移無關(P>0.05)；miR-4317表達水平與淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤TNM分期有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、浸潤深度、分化程度無關(P>0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中miR-133a-3p和miR-4317表達與患者臨床特征的關系

圖1 miR-133a-3p與患者預后的Kaplan-Meier生存曲線

2.3miR-133a-3p和miR-4317表達與患者預后的關系 (1)miR-133a-3p表達對預后的影響：以miR-133a-3p中位數(0.34)為界，將胃癌患者分為miR-133a-3p高表達組(n=30)和miR-133a-3p低表達組(n=30)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，miR-133a-3p高表達組與低表達組術后5年生存率為26.67%(8/30)和20.00%(6/30)，術后生存時間為(27.57±2.55)個月和(20.80±2.30)個月，兩組之間生存率差異有統計學意義(Log Rankχ2=17.920，P=0.001)，見圖1。(2)miR-4317表達對預后的影響：以miR-4317表達量中位數(0.49)為界，將胃癌患者分為miR-4317低表達組(n=30)和miR-4317高表達組(n=30)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，miR-4317高表達組與低表達組術后5年生存率為30.00%(9/30)和16.67%(5/30)，術后生存時間為(32.97±2.56)個月和(24.51±2.55)個月，兩組生存率差異有統計學意義(Log Rankχ2=21.130，P=0.001)，見圖2。

圖2 miR-4317與患者預后的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

胃癌是目前我國最為常見的惡性腫瘤之一，主要來自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，手術切除是目前胃癌治療的主要手段，但是，由于胃癌在早期階段無明顯的臨床癥狀，因此，大多數患者確診時已經處于癌癥晚期，所以預后較差[15]。在中國，胃癌仍然是一個沉重的負擔，對這種疾病沒有有效的治療方法，準確預測胃癌患者的預后對于胃癌患者的治療是非常重要的。到目前為止，TNM分期、淋巴結轉移、臨床分期等特征在臨床應用中，對預測胃癌患者的預后，指導個體治療有重要意義[16]。然而，這些特征的應用還不能夠滿足臨床需求。目前人們對miR的研究越來越多，研究認為，一些miR具有預測胃癌和預后生物標志物的潛力，例如miR-335-5p，miR-558和miR-145-5p[17-19]。因此尋找特異性的早期預測標志物，能夠早期預測和術后預警胃癌患者生存的檢測指標具有重要的臨床意義。

miR是一類高度保守的非編碼RNA分子，在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的作用，可以作為腫瘤分子的標志物，在腫瘤的早期預測和治療過程以及患者的預后判斷中發揮重要的作用[7]。很多癌癥如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，腫瘤組織和正常組織對比，miR存在差異性表達[20-22]。miR-133序列首次在小鼠上被發現，人類基因組中有3個已知的miR-133：miR-133a-1、miR-133a-2和miR-133b[23]。有研究通過對TCGA數據庫進行miR-Nomes分析發現miR-133a家族在胃癌中表達均為下調趨勢，并且通過SGC-7901、MNK-45胃癌細胞系和原發胃癌組織進行驗證，證實了該結果，表明miR-133a在胃癌的發生和發展過程中發揮重要作用[24]；miR-133a-3p在胃癌中表現為異常表達，有研究證明miR-133a-3p能夠通過靶向調控Mcl-1和Bcl-xL促進細胞發生凋亡[25]。miR-4317位于18p11.31，是一種新發現的miR，目前，已有一些研究報道了miR-4317在幾種腫瘤中的表達模式和生物學功能[12-13]。在非小細胞肺癌中，miR-4317表現為低表達，同時miR-4317高表達與肺癌晚期臨床分期有關，具有較好的總體生存率，miR-4317表達可以通過靶向成纖維細胞生長因子9來抑制細胞的增殖和轉移[13]。另一方面，在胃癌中，miR-4317表達也表現為下調，其高表達可以通過靶向ZNF 322來抑制人胃癌細胞的增殖[14]。

本文通過RT-qPCR驗證miR-133a-3p和miR-4317在60例胃癌組織和對應的癌旁正常組織中表達水平，發現相對于癌旁正常組織，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌組織中表達均顯著下調。同時通過對胃癌患者的臨床特征進行分析，結果顯示miR-133a-3p表達水平和TNM分期、淋巴結轉移有關，而與患者的年齡、性別以及分化程度、浸潤深度和遠處轉移無關。在胃癌組織中，當miR-133a-3p表現低表達時，患者發生明顯淋巴結轉移，并且具有較晚的分期；以上結果表明miR-133a-3p在胃癌的發生和發展中主要發揮抑癌的作用，它的高表達與腫瘤的惡性程度有關。同時預后顯示，miR-133a-3p高表達的患者具有較好的預后和較高的術后生存率，可以作為判斷患者預后情況的一項指標。miR-4317表達水平和遠處轉移、TNM分期、淋巴結轉移存在有關，而與患者年齡、性別和浸潤深度以及分化程度無關。miR-4317表達下調時，胃癌患者容易發生遠端轉移，并且發生明顯的淋巴結轉移，腫瘤具有較晚的分期；表明miR-4317在胃癌的發生和發展中主要發揮抑癌功能，同樣它的高表達與腫瘤的惡性程度有關。同時預后顯示，miR-4317高表達的患者具有較好的預后和較高的術后生存率，可以作為判斷患者預后情況的一項指標。

在胃癌的發生和發展過程中，miR-133a-3p和miR-4317可能發揮著癌基因的功能，miR-133a-3p和miR-4317的高表達能夠抑制胃癌的腫瘤形成和惡性進展過程，且均與患者的不良預后密切相關。因此miR-133a-3p和miR-4317很可能作為胃癌預測和預后判斷的潛在靶點。

4 結 論

本研究表明，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌中的表達均明顯下調，并與胃癌的進展和預后不良有關，提示其可能作為胃癌預測的潛在生物標志物和治療靶點。