非小細胞肺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3的表達及其對巨噬細胞活性的影響

魏徵霄，何雪梅

(1.四川金域醫學檢驗中心有限公司實驗室，四川成都 610000；2.西南醫科大學附屬醫院實驗中心，四川瀘州 646000)

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中發病率最高的腫瘤疾病，其發病人數占據肺癌總數的80%，也是導致肺癌患者死亡的主要原因[1-2]。大多數NSCLC患者確診時已為中晚期，由于免疫系統失調，癌細胞快速增殖并轉移到其他部位，導致預后極差，5年生存率約為20%[3]。有研究指出，免疫系統在腫瘤細胞的增殖、轉移過程中發揮了重要作用，尤其是T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域分子3(Tim-3)是T細胞表面重要的信號分子，具有負性免疫調節作用，與相應的配體結合可激活相關信號通路從而抑制Th1細胞功能[4-5]。程序性死亡蛋白配體-1(PD-1)作為負性調控分子，與T細胞耗竭密切相關[6-7]。有報道顯示，腫瘤疾病中巨噬細胞活化可影響相關生長因子而促進癌細胞的生長、轉移、浸潤，加劇病情進展[7-9]。但在NSCLC中，外周血、肺癌組織、正常組織Tim-3 和PD-1的表達對巨噬細胞活化有何影響未見報道。本研究旨在探討NSCLC患者外周血、腫瘤組織及正常組織中CD4+T細胞上Tim-3和PD-1的表達及其對巨噬細胞活性的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取西南醫科大學附屬醫院2017年1月至2018年6月收治住院的首次診斷為NSCLC的64例患者作為研究對象。研究對象納入標準：(1)首次診斷為NSCLC，且病理HE染色確診者；(2)屬原發性腫瘤者；(3)行手術切除術后未進行放療及化療者；(4)臨床資料完整者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)肝腎功能異常、合并心腦血管疾病者；(3)精神異常不配合者。入選患者中男35例，女29例；年齡51～74歲，平均(64.73±9.28)歲；肺鱗狀細胞癌42例，腺癌22例；根據2009年UICC第7版TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期27例，Ⅲ期37例。同時，選取40例健康者作為健康對照組，其中男22例，女19例；年齡48～72歲，平均年齡(62.18±8.75)歲，本研究經西南醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會同意后開展。

1.2方法

1.2.1標本采集 治療前，清晨采集NSCLC患者空腹靜脈血(4 mL),3 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃凍存備用。同時，抽取健康對照組人群靜脈血作為對照?；颊吆炇鹬橥鈺?，收集手術切除的肺癌組織標本，以及癌旁5 cm以上的正常肺組織(HE染色證實無腫瘤浸潤)。樣品制備：取部分腫瘤組織和對應的正常組織置于含有慶大霉素(900 IU/mL)、青霉素(500 IU/mL)及鏈霉素(500 μg/mL)的無血清培養基中，并將組織剪切成 1～2 mm3的組織碎塊；采用消化酶液體(膠原酶Ⅰ1 μg/mL，膠原酶Ⅳ1 μg/mL，DNase 25 μg/mL，2%胎牛血清混合配置)消化30 min，經Percoll組織標本分離液獲取單細胞懸液備用。

1.2.2流式法檢測外周血及肺組織Tim-3和PD-1表達 流式法檢測在 CD4+T 細胞上Tim-3和 PD-1的表達：取外周抗凝血，腫瘤組織及正常組織單細胞懸液各 100 μL，然后加入5 μL熒光標記的特異性抗體，包括抗Tim-3-PE、抗 PD-1-FITC及抗 CD4-PerCP-cy5.5，排除死細胞后混勻置于冰上避光孵育20 min；同時，設定各對照管。反應完畢后，將1 mL紅細胞裂解液加至外周血流式管中，振蕩混勻，避光放置于37 ℃恒溫箱中反應 20 min，腫瘤組織及癌旁組織單細胞懸液管可略過此步驟。將含有5%牛血清清蛋白及0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(FACS緩沖液，2 mL)離心后，去除上清液，再用 300 μL 的 FACS 緩沖液重懸。最后，采用FACS AriaⅡ流式細胞儀進行數據采集，通過FlowJo軟件分析數據，計算陽性細胞比例。

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg1) mRNA水平 各組肺組織40 mg，根據試劑盒說明書，采用TRizol法提取總RNA，測定水平；然后根據cDNA Kit試劑盒進行反轉錄。GAPDH、iNOS和Arg1 mRNA水平按照操作說明，在Takara qPCR儀上進行檢測。反應體系中總體積10 μL：cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應條件：95 ℃預熱3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s；循環40次。每個樣品設置3個重復，并以GAPDH作為內參測定iNOS和Arg1 mRNA水平；定量PCR特異產物通過熔解曲線分析，以2-ΔΔCt表示相對基因表達變化。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1外周血中Tim-3和PD-1的陽性表達比較 見圖1，肺癌患者外周血中CD4+T淋巴細胞上Tim-3表達百分比為4.96%(0.94%～28.46%)，PD-1表達百分比為24.13%(12.05%～33.64%)，均顯著高于健康對照組的Tim-3和PD-1表達水平[2.05%(0.54%～7.04%)及10.25%(3.12%～20.68%)]，差異均有統計學意義(P=0.021，P=0.005)。且肺癌患者外周血CD4+T 淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達水平為4.36%(2.73%～27.94%)，明顯高于其在健康對照組外周血中的表達[2.63%(1.27%～25.08%)]，差異有統計學意義(P=0.008)。

2.2肺組織中Tim-3和PD-1的陽性表達比較 見圖2，肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3表達明顯高于癌旁正常組織(28.52%vs. 11.59%)，差異有統計學意義(P=0.016)；同時肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上PD-1表達水平也顯著高于正常組織(41.73%vs. 20.26%)，差異有統計學意義(P=0.007)。進一步分析肺組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1的共表達情況，肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+共表達明顯高于正常組織(36.72%vs. 16.28%)，差異有統計學意義(P=0.011)。

圖1 外周血CD4 陽性細胞上Tim-3和 PD-1表達水平比較

2.3肺組織中巨噬細胞活性物質iNOS和Arg1 mRNA水平比較 與癌旁正常組織比較，肺癌組織中iNOS mRNA略有降低(P>0.05)，而Arg1 mRNA水平則顯著升高，差異有統計學意義(t=3.953,P=0.012)。見表2。

表2 肺組織中巨噬細胞活性物質iNOS和Arg1 mRNA水平比較

2.4肺組織中Tim-3和PD-1表達與巨噬細胞活性的相關性 采用Pearson相關分析統計發現，肺組織中Tim-3、PD-1表達和Tim-3+PD-1+共表達與巨噬細胞活性iNOS/Arg1比值均呈負相關(P<0.05),見表3。

表3 肺組織中Tim-3和 PD-1表達與巨噬細胞活性的相關性

圖2肺組織CD4陽性細胞上Tim-3和PD-1表達水平比較

3 討 論

腫瘤細胞增殖、轉移、浸潤及擴散過程中，巨噬細胞及其炎癥因子對促進腫瘤血管生長起著重要作用，巨噬細胞活化可加速機體代謝，通過免疫系統介導相關信號通路促使腫瘤細胞增殖、擴散及轉移，導致疾病惡化[10-11]。有研究發現，Tim-3和 PD-1等負性調控因子，在惡性腫瘤中CD4+T淋巴細胞上大量表達，與相應的配體結合可激活相關信號通路從而抑制Th1細胞功能，其增高導致負性免疫調節，加快了腫瘤細胞的侵襲、增殖及轉移環節，正常細胞更易發生凋亡，預后極差[12]。

本研究得到了類似的結果，肺癌患者外周血中CD4+T淋巴細胞上Tim-3、PD-1表達百分比為4.96%和24.13%，均顯著高于健康對照組的2.05%及10.25%(P<0.05)；且肺癌患者外周血 CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+的表達水平為4.36%，也明顯高于健康對照組的2.63%，這一結果提示，NSCLC患者肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1高表達是腫瘤發生、發展的重要因素。此外，本研究還發現肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3表達明顯高于癌旁正常組織，同時肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上PD-1表達水平也顯著高于正常組織。為進一步分析肺組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和 PD-1的共表達情況，檢測得到肺癌組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3+PD-1+共表達明顯高于正常組織。這證實Tim-3通過提高調節性T細胞擴增，再介導PD-1信號通路負性調控T細胞的免疫應答，形成負性的腫瘤微環境導致腫瘤免疫逃逸。

前期研究證實，腫瘤疾病中巨噬細胞活化，例如促使M1型巨噬細胞轉變為M2型巨噬細胞可分泌相關生長因子而促進癌細胞的生長、轉移、浸潤，加劇病情進展[6-7]。本研究結果顯示，與癌旁正常組織比較，肺癌組織中M1巨噬細胞標志物iNOS mRNA略有降低(P>0.05)，而M2巨噬細胞標志物Arg1 mRNA水平則顯著升高，說明巨噬細胞活性發生變化。為探討肺癌組織中Tim-3和 PD-1表達與巨噬細胞活性的相關性，本研究采用了Pearson相關分析，發現肺組織中Tim-3、PD-1表達和Tim-3+PD-1+共表達與巨噬細胞活性iNOS/Arg1 比值均呈負相關，Tim-3、PD-1表達越高，Arg1 mRNA水平越高，iNOS/Arg1 比值越低，這和張娟等[6]的報道一致。

4 結 論

NSCLC患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細胞上Tim-3和PD-1表達上調，促使M1型巨噬細胞轉變為M2型，具有負性免疫調節作用。