慢性丙型肝炎患者血清miR-122、miR-222水平變化及其臨床意義*

楊馭媒，劉小琦，李新麗，鄭永利

(1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 610051；2.四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 610072；3.成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，四川成都 610066)

慢性丙型肝炎(CHC)是臨床常見的感染性疾病，其病理改變與乙型肝炎極為相似，包括肝細胞壞死和淋巴細胞浸潤。隨病情進展CHC患者可發(fā)生肝硬化，并且發(fā)生肝癌的風(fēng)險增加[1]。丙型肝炎病毒(HCV)主要通過輸血、針刺以及母嬰等方式傳播，目前國內(nèi)抗病毒治療方案仍以干擾素和利巴韋林聯(lián)合用藥為主，其療效受病毒和宿主等多方面因素影響，因此需要一種安全、無創(chuàng)的方法來評估治療效果和病情進展情況[2-3]。微小RNA(miR)是長度約20～25個核苷酸序列的非編碼RNA，可以抑制靶基因mRNA的表達，從而參與細胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)育及免疫預(yù)防等生理活動。最新的研究表明，miR在肝臟病理機制和生理功能的調(diào)控中有重要作用，其中miR-122和miR-222在病毒性肝炎患者中水平明顯上調(diào)，可能參與了肝星形細胞(HSC)的活化和肝纖維化的進展，監(jiān)測血清miR-122、miR-222水平變化對治療和病情評估有重要參考價值[4-6]。本研究主要分析了CHC患者血清miR-122、miR-222水平及其與肝功能和肝組織病理改變的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年2月至2019年2月在成都市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心進行治療的CHC患者共173例納入研究作為CHC組，男95例、女78例，年齡19～57歲、平均(42.61±9.08)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)年齡18～60歲；(3)完成經(jīng)皮肝組織穿刺活檢；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他病毒性肝炎或HIV感染；(2)伴肝臟腫瘤、脂肪肝及膽汁淤積癥等其他原發(fā)或繼發(fā)性肝病；(3)此前6個月內(nèi)曾行抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療；(4)肝移植患者；(5)肝組織活檢不符合標(biāo)準(zhǔn)者。另外，選取同期體檢合格的健康者120例作為對照組，男71例、女59例，年齡18～60歲、平均(43.29±8.76)歲。兩組人群年齡、性別等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清學(xué)指標(biāo)檢測 采集上述兩組人群空腹外周靜脈血2管各3 mL，3 500 r/min離心5 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆茫还懿捎萌樟?600-020型全自動生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、血清清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)水平；一管采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)進行miR-122、miR-222水平的檢測，試劑盒購自美國ABI公司。檢測步驟：先用miRNAVana PARIS試劑盒(美國Ambion公司)提取和純化miR，然后以特異性莖環(huán)引物(Applied Biosystems公司)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以此為模板進行PCR擴增，然后以miRNA-16為內(nèi)參檢測和計算miR-122及miR-222相對表達水平，所有操作均嚴(yán)格按照說明書要求完成。

1.2.2肝臟組織病理檢查 通過彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)(Philips HD7EX型)引導(dǎo)，經(jīng)皮穿刺獲取長度>1 cm的肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精染色后由3位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師根據(jù)《病毒性肝炎防治方案》進行閱片和診斷，肝炎活動度分級[8]：G0為無炎癥；G1為匯管區(qū)炎癥；G2為輕度匯管區(qū)周邊碎屑樣壞死(PN)或灶性壞死；G3為中度PN；G4為重度PN或橋樣壞死。肝纖維化分期：S0為無纖維化；S1為擴大的匯管區(qū)纖維化；S2為匯管區(qū)周圍纖維化但小葉結(jié)構(gòu)保留；S3為纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；S4為肝硬化。

2 結(jié) 果

2.1兩組人群肝功能指標(biāo)的比較 CHC組血清ALT、AST、GGT、ALP及TBIL水平均高于對照組，血清ALB水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組人群血清miR-122、miR-222水平的比較 CHC組血清miR-122和miR-222水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3不同肝炎活動度分級的CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較 隨著肝炎活動度分級增加，CHC患者血清miR-122和miR-222水平明顯升高(P<0.05)，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 兩組人群肝功能指標(biāo)的比較

表2 兩組人群血清miR-122、miR-222水平的比較

表3 不同肝炎活動度分級CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較

注：與G0比較，aP<0.05；與G1比較，bP<0.05；與G2比較，cP<0.05；與G3比較，dP<0.05。

2.4不同肝纖維化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較 隨著肝纖維化分期增加，患者血清miR-122水平明顯降低(P<0.05)，血清miR-222水平明顯升高(P<0.05)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同肝纖維化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較

注：與S0比較，aP<0.05；與S1比較，bP<0.05；與S2比較，cP<0.05；與S3比較，dP<0.05。

2.5miR-122、miR-222與肝功能、肝炎活動度及肝纖維化的相關(guān)性分析 血清miR-122水平與ALB和肝纖維化分期呈負相關(guān)性(P<0.05)，與肝炎活動度呈正相關(guān)性(P<0.05)；血清miR-222水平與ALT、ALB、肝炎活動度及肝纖維化分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 miR-122、miR-222與肝功能、肝炎活動度及肝纖維化相關(guān)性分析

3 討 論

CHC是世界范圍內(nèi)廣泛流行的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率雖然低于慢性乙型肝炎，但近年來呈明顯上升趨勢。全球HCV感染率約為3%，感染者數(shù)量超過1.7億，發(fā)展中國家占90%，其中55%～85%進展為慢性感染且5%～15%的患者可在感染20年后進展為肝硬化，威脅患者生命安全[9-10]。目前，肝病進展情況評價仍依賴于肝組織穿刺活檢，對人體損傷較大，患者耐受性較差，難以重復(fù)開展，因此尋找非侵入性的肝組織損傷和纖維化評估方法用于動態(tài)監(jiān)測肝臟病變進展，對臨床診斷、治療和預(yù)后評估均有重要意義[11]。

基因芯片技術(shù)研究表明HCV不僅可利用宿主細胞miR干擾靶基因表達而改變宿主環(huán)境，還可編碼自身miR以促進生存和繁殖。同時，宿主也通過調(diào)節(jié)miR表達而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。miR-122是首個被證明與HCV復(fù)制緊密相關(guān)的miR，可參與調(diào)節(jié)多種肝臟疾病的發(fā)生和進展，現(xiàn)已成為肝臟活動性損傷和修復(fù)的重要標(biāo)志物。miR-122對肝炎病毒復(fù)制和翻譯具有促進作用，因此在病毒性肝炎患者血清中水平可出現(xiàn)不同程度增高[12-14]。miR-222與miR-122具有相同種子序列，兩者靶基因約75%一致，故在病毒性肝炎患者中變化趨勢相似。有研究報道m(xù)iR-122和miR-222在CHC患者血清中表達水平均明顯升高且對評價患者肝功能損傷可能具有較大的價值[5]。本研究顯示，CHC患者血清miR-122和miR-222水平均高于健康人群，提示miR-122、miR-222與HCV感染關(guān)系密切。CHC患者血清miR-122和miR-222水平隨肝炎活動度分級增加而升高。Spearman秩相關(guān)分析顯示，miR-122與患者GGT水平和肝炎活動度分級呈正相關(guān)，miR-222與ALT和肝炎活動度分級呈正相關(guān)，這表明監(jiān)測miR-122、miR-222水平變化可反映肝組織炎癥水平，為CHC診斷和病情評估提供參考依據(jù)。

CHC隨病情進展常導(dǎo)致肝組織損傷、壞死和纖維化。miR-122主要在肝臟組織中表達，肝纖維化早期表達水平較高，當(dāng)肝臟損傷和纖維化加重時，其表達水平常出現(xiàn)明顯下調(diào)，是肝纖維化評價常用的標(biāo)志物[15]。PIROLA等[16]對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-122水平隨著肝纖維分期升高而降低。本研究顯示，隨著肝纖維化分期升高，CHC患者血清miR-122水平降低，兩者呈負相關(guān)，與APPOURCHAUX等[6]研究結(jié)果一致，其原因主要為晚期肝纖維化患者正常肝細胞數(shù)目大幅度減少導(dǎo)致miR-122水平下降。HSC因炎癥或機械損傷激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要病理和生理過程。miR-222在HSC細胞中表達水平明顯上調(diào)，可能參與肝纖維化過程的調(diào)節(jié)，同時有研究認為與肝纖維化早期比較，晚期乙肝患者肝組織miR-222表達水平明顯升高[17-19]。本研究顯示，CHC患者血清miR-222水平隨肝纖維化分期升高明顯增加，兩者呈正相關(guān)，可見肝纖維化患者miR-122和miR-222表達水平變化趨勢相反。其原因為miR-122主要由肝細胞釋放，故在病毒性肝炎等疾病導(dǎo)致肝細胞活動增強時表達增加，在肝細胞數(shù)量減少的肝纖維化等病變中表達減少。miR-222在HSC細胞中表達，在肝組織炎癥和纖維化時表達水平均明顯增加。因此，聯(lián)合檢測miR-122和miR-222可用于判斷肝臟病變的類型及其嚴(yán)重程度，而且有助于減少對穿刺活檢的依賴，可以為CHC患者病情監(jiān)測和預(yù)后判斷提供參考。

4 結(jié) 論

CHC患者血清miR-122和miR-222水平均明顯升高。其中miR-122水平隨肝纖維化分期增加而下降；miR-222表達水平則隨肝纖維化分期增加而升高。檢測血清miR-122和miR-222表達水平，可為CHC病情監(jiān)測和預(yù)后評估提供客觀參考依據(jù)，但若要進入臨床應(yīng)用尚需更多研究定量分析其預(yù)測價值。