高爾基體蛋白73對(duì)抗病毒治療慢性乙型肝炎患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值

劉沁雨，常 越，張 青，丁玉平，李 海

慢性病毒性肝炎是目前全球范圍內(nèi)引起肝臟疾病的主要病因，其中乙型病毒性肝炎對(duì)中國(guó)乃至東南亞的威脅尤為嚴(yán)重[1]。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，2015年全球范圍內(nèi)約有3.5%人口HBsAg檢測(cè)為陽(yáng)性，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者高達(dá)2.57億。肝臟疾病常由肝炎進(jìn)展至肝纖維化、肝硬化，后繼續(xù)發(fā)展成為不可逆的肝衰竭、肝細(xì)胞癌等終末期疾病，僅2015年全球因乙型肝炎病毒感染而導(dǎo)致的相關(guān)死亡人數(shù)達(dá)88.7萬(wàn)[2]。因此，早期發(fā)現(xiàn)CHB臨床疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)有助于改善患者預(yù)后，但因肝臟疾病進(jìn)展較為隱匿，除肝活檢這一金標(biāo)準(zhǔn)外目前臨床缺乏準(zhǔn)確高效的檢測(cè)手段。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)高爾基體蛋白73(Golgi protein 73, gp73)對(duì)肝硬化具有較優(yōu)的診斷價(jià)值[3]；同時(shí)還有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，人尾肢同源蛋白2(people end limb homologous protein 2, pygo2)對(duì)肝硬化也具有一定的診斷價(jià)值[4]；但二者對(duì)已進(jìn)行長(zhǎng)期抗病毒治療的CHB患者是否具有相同診斷價(jià)值目前尚不明確。因此，本研究選取具有2年以上抗病毒治療的CHB代償期肝硬化患者，探究gp73與pygo2對(duì)CHB代償期肝硬化的診斷效能，旨在尋找更有效的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月—6月于中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心及天津市西青醫(yī)院就診CHB患者的一般資料，經(jīng)篩選共85例患者入組，其中男57例，女28例;年齡(50.55±10.50)歲。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合臨床表現(xiàn)及檢查結(jié)果，將入選CHB患者分為肝炎組51例和代償期肝硬化組34例。①納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者HBsAg陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月；均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中相關(guān)CHB或CHB代償期肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；均規(guī)律服用核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒藥物超過(guò)2年；年齡18～75歲。②排除標(biāo)準(zhǔn)：除CHB外合并其他肝臟炎癥疾病者；伴有心、腦、肺、腎等重要臟器損傷者；未能長(zhǎng)期按說(shuō)明書(shū)規(guī)律服用抗病毒藥物者；伴有惡性腫瘤者；研究人員認(rèn)為患者因各種原因無(wú)法完成本研究者。所有患者均已知曉本研究目的及意義，并簽署知情同意書(shū)，且本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1基本資料采集：收集患者的一般資料如性別、年齡，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)生化指標(biāo)，包括總膽紅素(total bilirubin, TBil)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count, PLT)。生化指標(biāo)采用西門(mén)子全自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)測(cè)定，PLT采用血液細(xì)胞分析儀(型號(hào)：希森美康xs-1000i)進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)收集患者影像學(xué)指標(biāo)，包括腹部彩超和FibroScan(型號(hào)：FibroScan502)，主要分析患者肝硬度測(cè)定(liver stiffness measurement, LSM)值。LSM值測(cè)定需至少成功10次，取中位數(shù)，同時(shí)需滿足四分位間距與中位數(shù)的比值<0.3[5]。

1.2.2血清gp73和pygo2蛋白檢測(cè)：收集患者采血當(dāng)日血液離心后的上層血清，至少0.5 ml，并凍存于-80℃冰箱保存。血清gp73和pygo2蛋白濃度測(cè)定均按照試劑盒(gp73試劑盒購(gòu)自海南眾森生物科技有限公司，pygo2試劑盒購(gòu)自Abbexa Ltd.)提供的說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行，測(cè)定方法采用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法。樣本于2019年8月進(jìn)行統(tǒng)一測(cè)定，全部檢測(cè)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)量3次，確保無(wú)異常數(shù)值后選定為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3基于4因子的纖維化指數(shù)(fibrosis index based on the 4 factors, FIB-4)診斷模型：計(jì)算公式：FIB-4=(年齡×AST)/(PLT×ALT1/2)[6]

1.2.4天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和血小板比率指數(shù)(aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index, APRI)診斷模型：計(jì)算公式：APRI=(AST/AST正常參考值上限)×100/PLT(109/L)[6]

2 結(jié)果

2.1試劑盒效能檢測(cè) 本研究中g(shù)p73酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)范圍為1.00～475.00 ng/ml，pygo2為1.00～10.00 ng/ml，gp73和pygo2蛋白檢測(cè)結(jié)果均在上述范圍內(nèi)；多次實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，線性系數(shù)良好；批內(nèi)或批間重復(fù)性測(cè)量變異系數(shù)均小于15%。

2.2基本資料比較 經(jīng)K-S檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)年齡符合正態(tài)分布(P>0.05)，且方差齊(P>0.05)；其他數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，代償期肝硬化組TBil、ALP、GGT、APRI、FIB-4、LSM值明顯高于肝炎組，PLT明顯低于肝炎組(P<0.05)。2組性別、年齡、ALT和AST比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組CHB患者的基本資料比較

注：CHB為慢性乙型肝炎，TBil為總膽紅素，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ALP為堿性磷酸酶，GGT為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，PLT為血小板計(jì)數(shù)，LSM為肝硬度測(cè)定，F(xiàn)IB-4為基于4因子的纖維化指數(shù)，APRI為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和血小板比率指數(shù)

2.3gp73和pygo2蛋白濃度比較 將2組的gp73和pygo2蛋白濃度進(jìn)行箱型圖繪制，可見(jiàn)2種蛋白濃度呈非正態(tài)分布。見(jiàn)圖1和2。其中代償期肝硬化組的gp73和pygo2蛋白濃度分別為(16.62±15.48)ng/ml和(0.73±1.01)ng/ml，肝炎組的gp73和pygo2蛋白濃度分別為(1.65±1.56)ng/ml和(1.13±2.23)ng/ml。代償期肝硬化組的gp73蛋白濃度明顯高于肝炎組(P<0.05)；而2組的pygo2蛋白濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4gp73和pygo2蛋白對(duì)CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值 將gp73和pygo2蛋白進(jìn)行ROC曲線繪制，結(jié)果顯示gp73的AUC=0.926，pygo2的AUC=0.503，可見(jiàn)gp73對(duì)抗病毒治療CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值明顯優(yōu)于pygo2。gp73最佳診斷點(diǎn)為2.7 ng/ml，敏感度91.2%，特異性86.3%；pygo2最佳診斷點(diǎn)為0.3 ng/ml，敏感度與特異性分別僅為50.0%、56.9%。見(jiàn)圖3。

圖1 2組CHB患者的gp73蛋白濃度比較

CHB為慢性乙型肝炎，gp73為高爾基體蛋白73；與肝炎組比較，aP<0.05

圖2 2組CHB患者的pygo2蛋白濃度比較

CHB為慢性乙型肝炎，pygo2為人尾肢同源蛋白2

圖3 gp73和pygo2蛋白對(duì)抗病毒治療CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值

CHB為慢性乙型肝炎，gp73為高爾基體蛋白73，pygo2為人尾肢同源蛋白2

2.5常規(guī)無(wú)創(chuàng)診斷方法對(duì)CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值 將入組患者APRI、FIB-4、LSM值、gp73和pygo2蛋白同時(shí)進(jìn)行ROC曲線的繪制，結(jié)果顯示gp73的AUC=0.926、LSM值的AUC=0.757、FIB-4的AUC=0.742、APRI的AUC=0.713、pygo2的AUC=0.503。可見(jiàn)gp73對(duì)抗病毒治療CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值優(yōu)于其他常規(guī)無(wú)創(chuàng)診斷模型。見(jiàn)圖4。

圖4 常規(guī)無(wú)創(chuàng)診斷方法對(duì)抗病毒治療CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值

CHB為慢性乙型肝炎，LSM為肝硬度測(cè)定，F(xiàn)IB-4為基于4因子的纖維化指數(shù)，APRI為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和血小板比率指數(shù)，gp73為高爾基體蛋白73，pygo2為人尾肢同源蛋白2

3 討論

目前，慢性病毒性肝炎是全球性健康問(wèn)題，也是我國(guó)及東南亞地區(qū)面臨的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，若不加以控制，患者易進(jìn)展至終末期肝臟疾病。相較于丙型肝炎，乙型肝炎的治療仍存在一定局限性，目前常口服核苷(酸)類(lèi)似物進(jìn)行抗病毒治療[7]。隨著抗病毒藥物的研發(fā)以及患者對(duì)CHB認(rèn)識(shí)的深入，CHB患者基本能夠做到長(zhǎng)期規(guī)律服用藥物。但有研究表明，即便長(zhǎng)期服用抗病毒藥物，仍有部分患者可進(jìn)展至失代償期肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[8]。由于肝臟疾病進(jìn)展存在一定的隱匿性，患者及臨床醫(yī)生不易察覺(jué)，當(dāng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀時(shí)肝臟已進(jìn)展至不可逆時(shí)期。因此，對(duì)于抗病毒治療的CHB患者仍應(yīng)該做到規(guī)律復(fù)查，對(duì)代償期肝硬化早發(fā)現(xiàn)、早治療。由于診斷金標(biāo)準(zhǔn)肝臟病理活檢存在一定不可重復(fù)性，無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)成為篩查CHB患者病情進(jìn)展的主要手段[9]。目前，F(xiàn)ibroScan及血清學(xué)指標(biāo)是較為常見(jiàn)的診斷技術(shù)，但都存在特異性和敏感性不高，易受其他因素影響等缺點(diǎn)[10]。近年來(lái)肝臟特異蛋白成為學(xué)者研究的熱點(diǎn)，本研究選取gp73和pygo2蛋白進(jìn)行研究，分析比較上述蛋白對(duì)抗病毒治療CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值。

我國(guó)于1999年開(kāi)始應(yīng)用核苷(酸)類(lèi)似物治療CHB，經(jīng)多年臨床觀察，絕大部分患者具有較高的依從性，獲得了較理想的抗病毒療效，同時(shí)藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)出現(xiàn)概率較小。本研究選取85例CHB及CHB代償期肝硬化患者為研究對(duì)象，入組患者都已長(zhǎng)期規(guī)律服用抗病毒藥物2年以上，病情較為穩(wěn)定。經(jīng)分析比較發(fā)現(xiàn)，肝炎組和代償期肝硬化組的ALT和AST比較無(wú)明顯差異，這可能是由于長(zhǎng)期服用抗病毒藥物，肝臟無(wú)明顯急性炎癥。但因代償期肝硬化組為早期肝硬化患者，存在一定程度的肝臟慢性損傷，同時(shí)可能伴有進(jìn)行性肝纖維化，GGT對(duì)此反應(yīng)較為敏感[11]，故代償期肝硬化組GGT明顯高于肝炎組。ALP主要分布于肝細(xì)胞的血竇側(cè)及毛細(xì)膽管的微絨毛上，因此代償期肝硬化組ALP高于肝炎組可能與肝硬化引起膽汁排出不暢，毛細(xì)膽管內(nèi)壓增高而誘發(fā)ALP大量釋放有關(guān)[12]。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，代償期肝硬化組TBil高于肝炎組，表明代償期肝硬化患者存在一定的膽汁淤積現(xiàn)象。另外，代償期肝硬化組PLT明顯低于肝炎組，這可能是由于肝硬化患者常伴有脾功能亢進(jìn)，同時(shí)乙型肝炎病毒對(duì)血小板生成具有一定的抑制作用[13]。故即便長(zhǎng)期規(guī)律服用抗病毒藥物，代償期肝硬化患者肝臟功能受損情況仍然較重，因此早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展、及早進(jìn)行有效治療有助于改善患者預(yù)后。

gp73于2000年由Kladney等[14]在成人巨細(xì)胞肝炎差異表達(dá)蛋白的基因篩選中被鑒定出來(lái)，后續(xù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)此蛋白在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，而在各種原因所致的肝硬化患者中高度表達(dá)。同時(shí)有研究還指出，肝硬化患者即便出現(xiàn)肝細(xì)胞比例下降情況，但肝細(xì)胞中g(shù)p73的表達(dá)量仍可超過(guò)整個(gè)肝組織水平，故高表達(dá)量gp73可能在肝病的細(xì)胞途徑中發(fā)揮重要作用[15]。同樣pygo2蛋白作為一種較新型的蛋白指標(biāo)，是wnt信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白，而wnt信號(hào)通路能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、活化肝星狀細(xì)胞等，進(jìn)一步引起肝纖維化的發(fā)生[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，代償期肝硬化組gp73蛋白濃度明顯高于肝炎組，而2組pygo2蛋白濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再通過(guò)建立ROC曲線進(jìn)一步分析2種蛋白對(duì)CHB患者代償期肝硬化的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，gp73的AUC可高達(dá)0.926，而pygo2的AUC僅為0.503。這進(jìn)一步說(shuō)明在本研究中g(shù)p73具有較優(yōu)的診斷效能，可能更適合對(duì)長(zhǎng)期抗病毒治療的CHB患者進(jìn)行篩查，特別是gp73濃度超過(guò)2.7 ng/ml時(shí)應(yīng)警惕代償期肝硬化的發(fā)生。本研究結(jié)果與姚明解等[3]和張麗君等[18]的研究結(jié)果相似。同樣Morota等[19]對(duì)美國(guó)人群的研究中也發(fā)現(xiàn)，gp73濃度在肝硬化患者中明顯高于肝炎患者。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于pygo2的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)朱傳龍等[4]、Li等[16]和李毓雯等[20]學(xué)者分別對(duì)慢性丙型肝炎、CHB和非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)行pygo2濃度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度加重pygo2濃度也隨之升高。本研究未能得出上述相應(yīng)結(jié)果，進(jìn)一步分析可能有以下原因：①有無(wú)抗病毒治療史：本研究入組患者全部進(jìn)行超過(guò)2年的有規(guī)律抗病毒治療，可能對(duì)pygo2的測(cè)定產(chǎn)生一定影響；②入組患者存在南北方地域差異：本研究入組患者為天津及周邊患者，多為北方人，而Li等[16]研究患者多為安徽、江蘇等南方患者，由于存在一定地域跨度可能對(duì)pygo2檢測(cè)造成影響；③入組患者年齡差距：本研究入組患者多為50歲以上患者，而Li等[16]的研究患者多為30歲左右的患者；④肝硬化程度不同：本研究入組肝硬化患者為代償期，而Li等[16]除納入肝硬化患者外也將肝纖維化患者納入進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)于肝硬化患者并未明確闡述其是否為代償期。目前，相較于診斷價(jià)值已被國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)的gp73，pygo2相關(guān)研究尚少，特別是對(duì)CHB肝硬化仍需大樣本多中心數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持。

目前無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)趨于成熟，相較于肝臟病理活檢這一有創(chuàng)檢測(cè)，其更具有可持續(xù)性、易重復(fù)測(cè)量、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、患者接受度高等優(yōu)點(diǎn)[21]。無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)主要包括血清學(xué)和影像學(xué)檢測(cè)，其中如APRI、LSM值等指標(biāo)已被國(guó)內(nèi)外各大指南推薦用于疾病的初篩及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)[22-23]。本研究選取其中有代表性的APRI、FIB-4和LSM值與2種蛋白進(jìn)一步比較，結(jié)果顯示gp73對(duì)于進(jìn)行長(zhǎng)期抗病毒治療CHB患者肝硬化的診斷價(jià)值最高，影像學(xué)LSM值優(yōu)于FIB-4和APRI，但pygo2診斷價(jià)值明顯低于上述4種無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)。故gp73適用于診斷進(jìn)行長(zhǎng)期抗病毒治療CHB患者的代償期肝硬化，而pygo2還需后續(xù)大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究基于真實(shí)世界研究，因入組患者意愿等情況，未能對(duì)所有入組患者進(jìn)行肝臟病理活檢，無(wú)法明確入組患者肝臟炎癥及纖維化情況。由于研究經(jīng)費(fèi)等原因，pygo2試劑盒數(shù)量及入組患者人數(shù)有限，未能進(jìn)行大樣本多人群的pygo2檢測(cè)?；谏鲜霾蛔?，還要繼續(xù)收集不同疾病進(jìn)展時(shí)期乙型肝炎病毒感染患者的臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究分析gp73和pygo2的診斷效能。本研究結(jié)果顯示gp73濃度超過(guò)2.7 ng/ml可能預(yù)示CHB患者將或已發(fā)展成為代償期肝硬化，此時(shí)肝硬化具有逆轉(zhuǎn)的可能性，應(yīng)采取積極有效的治療手段，改善患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，pygo2對(duì)進(jìn)行長(zhǎng)期抗病毒治療CHB患者肝硬化的診斷價(jià)值相對(duì)較低，其臨床價(jià)值還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。