自體脂肪間充質干細胞移植對急性心肌梗死大鼠心室重構及氧化應激的影響

張 建，鐘 莉

急性心肌梗死主要是冠狀動脈血流急性中斷，心肌細胞供血不足而引起壞死的一類心臟疾病，而梗死后繼發的心力衰竭、心源性休克等是患者死亡的主要原因[1]。盡管急性心肌梗死的臨床治療已取得顯著的進步，但治療效果仍存在一定的局限性，無法修復已壞死的心肌細胞。急性心肌梗死后心室重構和心肌細胞丟失是心力衰竭進展或患者死亡的主要因素[2]。因此，在臨床上急需一種可以抑制急性心肌梗死患者心室重構和修復壞死心肌細胞的治療方法。干細胞可在特定環境和條件下，分化成多種組織細胞，具有自我更新、多向分化的能力，已逐漸應用于急性心肌梗死的治療[3-4]。目前，應用于心血管疾病的干細胞種類很多，相關研究表明，自體脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells, ADSCs)可有效改善缺血缺氧心肌損傷，促進血管新生和心肌功能的恢復[5]，但其具體作用機制尚未完全明了。本研究擬從心室重構和氧化應激方面探討ADSCs對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 27只雄性SD大鼠由北京實驗動物研究中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2019-0005。周齡6～8周，體重200～240 g，適應性喂養7 d后，隨機分為假手術組、模型組及ADSCs組，每組9只，按組別分籠飼養，自由攝食進水。

1.2ADSCs的分離、培養與鑒定 無菌條件下，取SD大鼠腹股溝皮下脂肪，剪碎后用Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司)消化為乳糜狀，終止消化后加入培養基，過濾去除上層乳糜層，加入培養基重懸細胞后接種，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h換液，隨后2～3 d換液；觀察細胞狀態，待細胞融合至80%左右時傳代，取3～5代的細胞備用，經流式細胞儀鑒定符合間充質干細胞標準[6]。

1.3模型的建立與處理 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取仰臥位固定，連接呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司)和心電圖(上海海哲儀器設備有限公司)，于左側第3和第4肋間作切口，逐層分離肌群和胸膜，暴露心臟，分離左前降支血管，于左心耳下緣處結扎，當心臟搏動減弱，呈暗紅色，心電圖顯示R波升高、ST段明顯抬高時，表明結扎成功[7]。術后給予青霉素抗感染處理，注意保暖。假手術組僅穿線、不結扎。ADSCs組于心肌梗死區邊緣注射ADSCs細胞懸液200 μl，分4點注射；假手術組和模型組則以等量培養基替代。

1.4觀察指標與檢測方法

1.4.1超聲心動圖檢測：于移植28 d后行心臟超聲檢測，檢測各組大鼠左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter, LVEDD)及左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter, LVESD)。

1.4.2HE染色：于移植28 d后處死大鼠，迅速取出心臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，經常規石蠟包埋切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理變化。

1.4.3Masson染色：參照上述方法制備心肌組織切片，進行Masson染色(武漢純度生物科技有限公司)；纖維組織替代梗死組織被染成藍色，正常心肌組織被染成紅色，計算心肌纖維化程度。

1.4.4氧化應激因子水平檢測：于移植28 d后處死大鼠，取梗死區心肌組織，加入生理鹽水冰上勻漿，離心分離上清液，參照丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行操作，檢測大鼠心肌梗死組織中氧化應激因子MDA、SOD及GSH-PX的含量。

1.4.5Western Blot檢測：于移植28 d后處死大鼠，取梗死區心肌組織，加入RIPA裂解液進行勻漿，離心取上清液，經BCA法檢測蛋白濃度；取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，待蛋白電泳至下端時，濕轉至PVDF膜上；浸泡于5%脫脂奶粉中孵育1.5 h，封閉非特異性蛋白位點；添加相應蛋白一抗(美國Cell Signaling公司)，分別為基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)一抗(1∶1500)和鼠抗β-actin(1∶1000)，4℃搖晃過夜；添加二抗(美國Cell Signaling公司)，MMP-2添加山羊抗兔(1∶8000)，β-actin添加山羊抗鼠(1∶8000)，37℃搖晃1 h；經ECL法顯示蛋白條帶。

2 結果

2.1超聲心動圖指標比較 3組大鼠的各超聲心動圖指標比較差異均有統計學意義(P<0.01)。與假手術組比較，模型組的LVEF水平顯著降低，LVEDD及LVESD水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，ADSCs組的LVEF水平顯著升高，LVEDD及LVESD水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2心肌組織病理變化 HE染色結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織形態學變化顯著，梗死區心肌細胞出現不同程度肥大、伸長或壞死，另有明顯水腫和炎性細胞浸潤，病變范圍廣泛；ADSCs組明顯可見病灶吸收，但仍伴有炎性細胞浸潤和纖維組織增生，病變程度較模型組輕。見圖1。

表1 3組大鼠的超聲心動圖指標的比較

注：ADSCs為脂肪間充質干細胞，LVEF為左心室射血分數，LVEDD為左心室舒張末期內徑，LVESD為左心室收縮末期內徑；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

圖1 3組大鼠的心肌組織病理變化(HE ×200)

ADSCs為脂肪間充質干細胞

2.3心肌纖維化程度比較 Masson染色結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中可見大范圍藍色的間質纖維區，梗死部分纖維增生嚴重；與模型組比較，ADSCs組間質纖維增生明顯減少。見圖2。假手術組、模型組和ADSCs組心肌纖維化程度分別為(7.51±5.32)%、(48.37±8.26)%和(26.41±7.15)%。3組纖維化程度比較差異有統計學意義(P<0.01)；與假手術組比較，模型組心肌纖維化程度顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，ADSCs組心肌纖維化程度顯著降低(P<0.05)。

圖2 3組大鼠的心肌纖維化程度(Masson ×400)

ADSCs為脂肪間充質干細胞

2.4氧化應激因子水平比較 3組MDA、SOD和GSH-PX水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。與假手術組比較，模型組的SOD和GSH-PX水平顯著降低，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，ADSCs組的SOD和GSH-PX水平顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5MMP-2蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組心肌梗死組織中MMP-2蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，ADSCs組心肌梗死組織中MMP-2蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。見圖3。

表2 3組大鼠心肌梗死組織中氧化應激因子水平的比較

注：ADSCs為脂肪間充質干細胞，MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，GSH-PX為谷胱甘肽過氧化物酶；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

圖3 3組大鼠心肌梗死組織中MMP-2蛋白表達水平比較

A.假手術組；B.模型組；C.ADSCs組；ADSCs為脂肪間充質干細胞，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2

3 討論

目前，骨髓間充質干細胞是研究最為廣泛的間充質干細胞，但骨髓間充質干細胞局限于取材部位，可獲細胞數量少，而且取材過程比較痛苦，因而臨床應用受到限制[8]。有研究發現，ADSCs與骨髓間充質干細胞具有相似的特性，而且ADSCs容易獲得，體外擴增簡單，是較為理想的間充質干細胞[9]。近年來，臨床應用表明間充質干細胞移植能明顯恢復急性心肌梗死后心肌功能。Jiang等[10]采用不同氧濃度缺氧處理ADSCs，發現3%氧處理后的ADSCs可有效改善心肌梗死大鼠的心功能，減少心肌梗死面積。張澤宇等[11]的實驗研究表明，從大鼠中分離ADSCs移植于心肌缺血再灌注大鼠模型，能明顯下調模型大鼠炎癥水平和心肌梗死面積，有效改善大鼠心肌功能，可能通過調節免疫細胞水平發揮保護作用。本研究通過結扎冠狀動脈前降支的方法構建急性心肌梗死大鼠模型，并發現移植ADSCs后，急性心肌梗死大鼠心肌組織病理變化明顯減輕，與上述研究結果相符。

急性心肌梗死發病過程中，大量心肌細胞損傷、丟失，甚至壞死，機體會啟動自我修復過程，即心室重構[12-13]。MMPs是巨噬細胞分泌的一類鋅離子依賴的內肽酶，可降解細胞外基質破壞心肌細胞，MMP-2是MMPs家族的成員之一，在急性心肌梗死心肌組織中高度表達[14]。近年來，大量研究揭示了心肌組織纖維化在心室重構中的作用。心室重構過程中有大量成纖維細胞被激活，分泌大量膠原纖維及細胞外基質沉積，導致心肌間質纖維化[15]。本研究結果發現，ADSCs可明顯逆轉心肌梗死后出現的心室壁變薄、心室擴大及舒縮功能下降的現象，并顯著下調MMP-2的表達。提示ADSCs可能通過下調MMP-2水平，防止心肌纖維化程度加重，從而抑制急性心肌梗死大鼠的心室重構。

近來研究發現，氧化應激也是心室重構發生的重要機制之一[16]。心肌缺血缺氧會引起大量氧自由基的沉積，對心肌細胞造成嚴重損傷，同時導致脂質過氧化物MDA的增多，進一步損傷心肌細胞[17]。本研究結果顯示，ADSCs可明顯上調心肌梗死組織中抗氧化劑SOD和GSH-PX水平，并降低MDA水平；提示ADSCs可能通過抑制氧化應激反應減輕心肌細胞損傷。師帥南等[18]研究也證明，ADSCs可調控氧化應激水平，減輕缺血再灌注損傷，與本研究結果相似。

綜上所述，本研究數據表明應用ADSCs移植治療急性心肌梗死大鼠，可修復其心肌組織病理改變，降低其心肌纖維化程度，抑制心室重構及氧化應激水平，阻礙急性心肌梗死的進展。但ADSCs是否通過分泌細胞因子起保護作用，尚待進一步研究證明。