大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞分化的影響及其分子機制研究

高丹丹，張玲玲，陳家樂，崔歡歡，溫曉昶，王 越，金 鑫

隨著我國人口老齡化的日漸加重，骨質疏松癥(osteoporosis, OP)作為最常見的骨骼疾病，已成為困擾老年人健康的重大疾病，尤其多見于絕經后女性[1-2]。目前，在臨床上治療絕經后OP首選雌激素替代療法。雖然應用雌激素能有效防止骨量減少，從而降低骨折發生率，但長期大量使用外源性雌激素會增加心血管事件、子宮內膜癌、血栓栓塞和乳腺癌的發病風險[3-5]。因此，研發不良反應小的抗絕經后OP藥物，已成為當前研究的熱點和難點。

植物雌激素是一類與雌激素有著類似化學結構，并且能與雌激素受體(estrogen receptor, ER)結合的天然化合物，具有與雌激素相似的作用[6]。大豆異黃酮具有耐受性好、不良反應少等優點，被認為是預防和治療絕經后OP的潛在藥物，近年來備受人們的關注[7]。大豆苷元是大豆異黃酮中主要的活性成分之一，因具有與雌激素類似的母核結構，所以具有類雌激素樣作用[8]。有相關研究表明，大豆苷元不僅能夠影響成骨細胞的形成，也影響破骨細胞的吸收[9-10]，且對絕經后OP具有預防和治療作用，但是其分子作用機制還不太明確。本研究以人成骨樣MG-63細胞為研究對象，該細胞具備特征性成骨細胞功能，兼表達ERα和ERβ雌激素受體亞型[11]，觀察大豆苷元對人成骨細胞分化的作用及其分子機制。本研究旨在進一步揭示大豆苷元對骨形成的影響及其分子作用機制，為臨床應用植物雌激素治療絕經后OP提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑 大豆苷元(純度>98%)購自中國北京藥品生物制品檢定所；DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國gibco公司；l7β-雌二醇和ICI 182,780購自美國sigma公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；人Ⅰ型膠原ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞株和細胞培養：人成骨樣MG-63細胞系為美國ATCC公司產品，購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。用含10% FBS的DMEM高糖培養液培養，培養液中加入鏈霉素100 μg/ml和青霉素100 U/ml，置于5% CO2，37℃培養箱中培養，2 d更換1次培養液，培養3～4 d進行1次傳代。

1.2.2細胞分組：取對數生長期的MG-63細胞密度為4×104/ml，接種于12孔板中，5% CO2，37℃培養箱中培養24 h后，更換含有1% FBS的無酚紅DMEM高糖培養基繼續培養24 h。然后將細胞分為對照組、雌二醇組、低、中和高濃度組，其中低、中和高濃度組分別加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元處理，雌二醇組加入0.1 μmol/L雌二醇處理，對照組不做任何處理。每個藥物濃度設立3個副孔，置于5% CO2,37℃培養箱分別培養2、4和6 d。

1.2.3比色法檢測ALP活性：各組細胞培養結束后，用PBS漂洗3次，將液體吸干凈，加入配制好的0.1% Triton X-100，每孔500 μl，作用3 min，用移液器充分吹打，收集至1.5 ml Ependorf管中，超聲波細胞粉碎儀破碎后，1500 r/min離心10 min，取上清液作為ALP活性測定的標本，參考試劑盒說明書檢測細胞上清液中ALP的活性。

1.2.4ELISA法檢測Ⅰ型膠原的含量：在不同的時間點收集細胞培養上清，根據試劑盒說明書進行操作測定細胞培養上清中Ⅰ型膠原蛋白的含量。取100 μl樣品或標準品加入孔中，加入檢測抗體并在37℃下孵育1 h。然后加入辣根過氧化物酶標記的抗體，孵育1 h。再加入TMB底物顯色劑，混勻后觀察顏色變化，最后加入終止液。立即讀取490 nm處的吸光度，并根據標準曲線計算Ⅰ型膠原分泌量。

1.2.5ER拮抗劑阻斷實驗：取對數生長期的MG-63細胞接種于12孔板中，密度為4×104/ml，5% CO2，37℃培養箱中培養24 h后，更換含有1% FBS的無酚紅DMEM高糖培養基繼續培養24 h。然后將細胞分為對照組、ICI組、大豆苷元組和大豆苷元+ICI組。其中大豆苷元+ICI組在藥物處理前先加入ICI 182,780(ERα以及ERβ拮抗劑)100 μmol/L，作用30 min，然后再加入大豆苷元作用最明顯的劑量0.1 μmol/L，ICI組和大豆苷元組分別加入100 μmol/L ICI 182,780和0.1 μmol/L大豆苷元處理，對照組不做任何處理。測定各組ALP和Ⅰ型膠原的分泌量。

1.2.6細胞轉染：利用脂質體法將pGenesil-ERα shRNA、pGenesil-ERβ shRNA、pGenesil-scrambled shRNA分別轉染至人成骨樣MG-63細胞中，按照參考文獻[12]所述，構建穩定轉染的MG-63/ERα shRNA、MG-63/ERβ shRNA和MG-63/scrambled shRNA細胞。將上述穩定轉染的細胞和未轉染MG-63細胞均分為對照組、大豆苷元組和雌二醇組，其中大豆苷元組加入0.1 μmol/L大豆苷元處理，雌二醇組加入0.1 μmol/L雌二醇處理，對照組不做任何處理。測定各組ALP和Ⅰ型膠原的分泌量。

2 結果

2.1大豆苷元通過增強ALP活性促進人成骨樣MG-63細胞分化成熟 用不同濃度的大豆苷元或雌二醇處理人成骨樣MG-63細胞2、4或6 d，分別測定細胞中ALP活性。研究結果顯示，大豆苷元和雌二醇均以時間依賴性的增強細胞中ALP的活性。與對照組比較，中、高濃度組和雌二醇組在培養4和6 d時可顯著增強細胞內的ALP活性(P<0.05)，而低濃度組只有在培養6 d時才顯著增強細胞內的ALP活性(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度的大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞ALP活性的影響

低、中和高濃度組分別加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元處理，雌二醇組加入0.1 μmol/L雌二醇處理，對照組不做任何處理；ALP為堿性磷酸酶

2.2大豆苷元通過增加Ⅰ型膠原分泌促進人成骨樣MG-63細胞分化成熟 用不同濃度的大豆苷元或雌二醇處理人成骨樣MG-63細胞2、4或6 d，分別測定細胞分泌的Ⅰ型膠原。研究結果顯示，與對照組比較，中、高濃度組和雌二醇組在培養4和6 d時能顯著提高Ⅰ型膠原的分泌(P<0.05)，而低濃度組只有在培養6 d時能提高Ⅰ型膠原的分泌(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度的大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞Ⅰ型膠原分泌的影響

低、中和高濃度組分別加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元處理，雌二醇組加入0.1 μmol/L雌二醇處理，對照組不做任何處理

2.3ER阻斷劑對大豆苷元促人成骨樣MG-63細胞分化的阻斷作用 研究結果顯示，與對照組比較，大豆苷元組細胞中ALP活性及Ⅰ型膠原分泌量明顯增加(P<0.05)，而ICI組細胞中ALP的活性和Ⅰ型膠原分泌量并無顯著變化(P>0.05)。與大豆苷元組比較，大豆苷元+ICI組細胞中ALP活性及Ⅰ型膠原分泌量明顯下降(P<0.05)。見圖3。

圖3 ER阻斷劑對大豆苷元誘導人成骨樣MG-63細胞中ALP活性和Ⅰ型膠原分泌量的影響

大豆苷元+ICI組應用100 μmol/L ICI 182,780以及0.1 μmol/L大豆苷元處理，ICI組和大豆苷元組分別應用100 μmol/L ICI 182,780和0.1 μmol/L大豆苷元處理，對照組不做任何處理；ALP為堿性磷酸酶；與對照組比較，aP<0.05；與大豆苷元組比較，cP<0.05

2.4大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞促分化作用由ERα和ERβ共同介導 應用大豆苷元或雌二醇處理未轉染及穩定轉染的MG-63細胞，隨后應用比色法和ELISA法分別檢測上述MG-63細胞ALP活性和Ⅰ型膠原的分泌量。研究結果顯示，雌二醇對MG-63/scrambled shRNA細胞ALP活性和Ⅰ型膠原分泌的促進作用較未轉染MG-63細胞差異無統計學意義(P>0.05)，對MG-63/ERα shRNA細胞ALP活性和Ⅰ型膠原分泌的促進作用則較MG-63/scrambled shRNA和未轉染MG-63細胞明顯減弱(P<0.05)，而對MG-63/ERβ shRNA細胞的作用影響不大(P>0.05)。大豆苷元對上述細胞ALP活性和Ⅰ型膠原分泌的促進作用無顯著差異(P>0.05)。見圖4。

圖4 大豆苷元對MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA細胞ALP活性和Ⅰ型膠原分泌的影響

大豆苷元組加入0.1 μmol/L大豆苷元處理，雌二醇組加入0.1 μmol/L雌二醇處理，對照組不做任何處理；ALP為堿性磷酸酶；與未轉染MG-63細胞比較，aP<0.05

3 討論

OP是一種漸進性、系統性疾病，表現為骨量減少、骨微觀結構退行性病變，患者多見于絕經后女性和老年男性[13-14]。絕經后OP是由于卵巢功能衰退，雌激素缺乏，導致骨量減少，骨組織結構發生變化，使骨脆性增加、易發生骨折[15-16]。有研究證實，黃酮類化合物能顯著促進骨的形成，探討其對成骨機制的研究已成為當今熱點之一[17]。大豆苷元為異黃酮類化合物，是一種與雌激素結構相似的植物雌激素。相關研究表明，提高異黃酮的攝入量可使大鼠骨密度上升，可預防因雌激素缺乏引起OP的發生[18]。人體ER有2種亞型分別為ERα和ERβ，存在于成骨細胞、破骨細胞及其前體細胞上，雌激素通過合并激活2種受體發揮骨保護作用[19]。因此，本研究選擇兼有2種ER表達的人成骨樣MG-63細胞為研究對象，研究大豆苷元對成骨細胞分化作用的影響，探討其與ER相關的分子機制。

本研究通過測定成骨細胞分化的2個重要標志即ALP活性和Ⅰ型膠原含量，評價大豆苷元對成骨細胞分化功能的影響。ALP屬于同源二聚體蛋白，對其活性的檢測是評價成骨細胞分化功能常見的方法之一，Ⅰ型膠原則是另一種檢測成骨細胞分化成熟的標志。從實驗結果中可得知，0.1～1.0 μmol/L的劑量范圍內，大豆苷元以劑量依賴的方式增強了人成骨樣MG-63細胞中ALP的活性和Ⅰ型膠原的含量，但大豆苷元在等濃度的條件下對ALP活性和Ⅰ型膠原分泌的促進作用要明顯弱于雌二醇。提示大豆苷元能通過增強ALP活性,提高Ⅰ型膠原分泌促進人成骨樣MG-63細胞分化成熟。先前的研究結果顯示，雌酚酮、雌酚酮-大黃酸混合物、雌二醇及葛根素均能促進人成骨樣MG-63細胞分化[20-21]；此外Qu等[22]研究發現，雌二醇和雷洛昔芬在人成骨細胞系hFOB、原代小鼠成骨細胞或骨髓培養物中增強了ALP和Ⅰ型膠原蛋白表達，上述報道與本次實驗結果基本一致。然而，也有報道較高濃度的異黃酮類化合物染料木素顯示出顯著的抑制作用，雷洛昔芬對ALP沒有影響。Davis等[23]報道結果顯示，細胞密度、雌二醇、血清等多種因素能夠影響大鼠成骨樣細胞系ROS 17/2.8和UMR-106-01的ER水平，可能導致ER的豐度波動，以誘導雌激素反應性，這些因素可能造成雌激素類物質對成骨細胞分化的測定結果不一致。

為了揭示大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞分化的潛在分子機制，本研究使用ICI 182,780進行阻斷，結果表明ER拮抗劑ICI 182,780能夠抑制大豆苷元增強人成骨樣MG-63細胞ALP活性和促進Ⅰ型膠原蛋白分泌的作用。表明大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞分化的影響主要由ER途徑介導。應用小RNA干擾技術進行脂質體轉染實驗，實驗結果進一步證明了大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞的影響主要由ERα和ERβ共同介導。Rickard等[24]研究發現，異黃酮類化合物染料木黃酮在人成骨細胞中發揮出弱雌激素樣作用也是由ERα和ERβ介導的；而Liao等[25]的實驗研究發現，染料木黃酮影響成骨細胞相關分化基因，只通過活化ERα基因的表達。推斷這些差異反應可能是由于以下幾種因素，如培養條件、細胞種類差異、分化程度以及不同細胞系和原代培養物中的各種ER含量等，上述結果還需要通過進一步的研究來證明。

綜上所述，大豆苷元可通過ER介導增強人成骨樣MG-63細胞中ALP活性，并促進Ⅰ型膠原的分泌，本實驗結果為大豆苷元進一步應用于臨床治療絕經后OP提供理論基礎。