一種呋喃西林酶聯免疫檢測方法的建立

李泳寧 彭臻菲 黃慧 蔡美虹 林清清

摘要[目的]建立一種飼料中呋喃西林酶聯免疫檢測方法。[方法]利用制備的人工抗原和高特異性單克隆抗體，采用間接競爭酶聯免疫技術建立呋喃西林檢測方法。[結果]在優化條件下，檢測抗原濃度為10 μg/mL，抗體稀釋度為1∶5 000。呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有較好的線性關系（R2=0.998 7），IC50為1.43 ng/mL。與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代謝物氨基脲的交叉反應率低于0.5%。飼料樣品中添加呋喃西林的平均回收率為87.5%～96.0%，變異系數為6.1%～9.7%。[結論]該方法快速、準確、靈敏，可用于飼料中呋喃西林的分析檢測。

關鍵詞呋喃西林;酶聯免疫檢測;單克隆抗體;飼料

中圖分類號R446.6文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2020）04-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.056

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Nitrofurazone

LI Yong-ning，PENG Zhen-fei，HUANG Hui et al（Fujian Health College，Fuzhou，Fujian 350101）

Abstract[Objective]To establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the determination of nitrofurazone in feed.[Method]The artificial antigen and the high specificity monoclonal antibodies against nitrofurazone were prepared.An indirect competitive ELISA for the determination of nitrofurazone in feed was established.[Result]The optimization of ELISA parameters were that the concentration of antigen was 10 μg/mL and the dilution multiples of antibodies was 1∶5 000.The good linear range was 0.1-10.0 ng/mL（R2=0.998 7） and IC50 was 1.43 ng/mL.The cross-reactivity （CR） rate was less than 0.5% with other nitrofurans such as furazolidone，furaltadone，furantoin and semicarbazide.The average recovery from artificially contaminated nitrofurazone of feed was 87.5%-96.0%，with coefficient of variation （CV） was 6.1%-9.7%.[Conclusion]The method developed is rapid，accurate and sensitive and will be helpful for rapid screening for nitrofurazone in feed.

Key wordsNitrofurazone;Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）;Monoclonal antibody;Feed

硝基呋喃類藥物是一類具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物，對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用[1]。呋喃西林是硝基呋喃類代表藥物之一，具有殺菌能力強、抗菌譜廣和價格低廉等優點，曾被廣泛使用在養殖業中。但越來越多的研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝產物具有一定的毒性作用，可誘發癌癥[2]，尤其是呋喃西林代謝物氨基脲對人體有致癌、致畸胎等副作用[3]。因此，越來越多的國家嚴禁使用呋喃西林藥物，而2002年我國農業部193號公告也禁止使用硝基呋喃類藥物在食用動物上。但是由于呋喃西林使用效果明顯、價格便宜，目前仍然存在違規用藥情況。因此，對呋喃西林的檢測顯得尤為重要。

目前，呋喃西林的方法主要有高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-質譜聯用法[6-7]。其中，高效液相色譜法可靠性較強且重復性好，廣泛應用于飼料以及動物食品中的殘留檢測，最低檢出限可達1 μg/kg;液相色譜-質譜聯用法具有高靈敏度、高選擇性的特點，最低檢出限可達0.50 μg/kg，但儀器設備要求高，檢測費用成本昂貴。近年來快速發展的免疫檢測法具有檢測速度快、靈敏度高和選擇性強等優點，廣泛應用于各類藥物殘留的檢測中，也是目前檢測的重要方向。由于呋喃西林在動物體內代謝迅速，而其代謝物可在機體內穩定存在，一般采用檢測呋喃西林代謝物來判定食用動物中是否存在藥物殘留，而對呋喃西林的免疫學檢測方法則報道較少。該研究利用合成的人工抗原和高特異性抗呋喃西林單克隆抗體建立呋喃西林免疫檢測方法，并進行飼料中呋喃西林的檢測方法研究，可望用于飼料樣品的大量篩查。

1材料與方法

1.1材料與儀器呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、呋喃唑酮和呋喃妥因購自東京化成工業株式會社;呋喃它酮和呋喃西林代謝物氨基脲購于德國Dr.Ehrenstorfer公司;卵清蛋白（ovalbumin，OVA）為Worthington公司產品;四甲基聯苯胺（3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB）為TIANGEN公司產品;HRP標記羊抗小鼠IgG購自北京莊盟公司。其他試劑均為分析純。NFZ-OVA人工抗原和抗呋喃西林單克隆抗體由福建衛生職業技術學院生物醫藥工程中心制備。SpectraMax M3型多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

該研究利用制備的抗呋喃西林高特異性單克隆抗體，采用間接競爭酶聯免疫技術建立呋喃西林檢測方法。結果表明，呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有較好的線性關系（R2=0.998 7），IC50為1.43 ng/mL。與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代謝物氨基脲的交叉反應率均低于0.5%。飼料樣品中添加3個濃度呋喃西林的回收率為87.5%～96.0%， CV值為6.1%～9.7%。可見該方法快速、準確、靈敏，可用于飼料中呋喃西林的分析檢測。

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