紅茂草異紫堇堿對LPS誘導小鼠RAW 264.7細胞炎癥因子的影響

王霞 王廷璞 袁毅君 高義霞 王鵬 趙強 趙仁生

摘要[目的]研究紅茂草異紫堇堿對細菌脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）誘導RAW 264.7細胞釋放炎性因子的影響。[方法]用CCK-8試劑盒方法檢測不同劑量紅茂草異紫堇堿（1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL）對RAW 264.7細胞的毒性作用;用硝酸酶還原法測定不同濃度紅茂草異紫堇堿（50、100、200和400 μg/mL）條件下細胞培養液中NO的濃度;用ELISA法測定添加不同濃度紅茂草異紫堇堿（100、200和400 μg/mL）干預4 h，再加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后細胞培養液中IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的含量，通過上述方法測定的結果來評價紅茂草異紫堇堿的抗炎作用。[結果]紅茂草異紫堇堿濃度在15、25 μg/mL時，可顯著促進RAW 264.7細胞增殖（P≤0.05）;并且在紅茂草異紫堇堿存在條件下，促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α釋放量都有不程度的降低，而抗炎因子IL-10和NO的釋放量有不同程度的升高。[結論]紅茂草異紫堇堿能夠抑制促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α的釋放;另一方面能夠促進抗炎因子IL-10和NO的釋放來抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥反應。

關鍵詞紅茂草異紫堇堿;RAW 264.7細胞;LPS;細胞炎癥因子

中圖分類號R285.5文獻標識碼A文章編號0517-6611（2020）04-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.051

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Isocorydine Alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde（DLF）on Inflammatory Factors in RAW264. 7 Cells Stimulated by LPS

WANG Xia，WANG Ting-pu，YUAN Yi-jun et al

（College of Bioengineering and Technology， Tianshui Normal University， Tianshui，Gansu 741001）

Abstract[Objective] To study the effects of isocorydine alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde （DLF） on secretion of inflammatory factors in RAW 264.7 cell stimulated by lipopolysaccharide，LPS. [Method]Toxic effect on RAW 264.7 cell with different doses of isocorydine alkaloid in DLF （ 1， 5， 15， 25， 50， 100， 200， 300 and 400 μg/mL） were detected by CCK 8 kit method. The concentration of NO in cell medium added different doses of isocorydine alkaloid in DLF （50， 100， 200 and 400 μg/mL） were detected by the enzyme nitrate reduction method. After pretreated with various concentration of isocorydine alkaloid in DLF（100， 200 and 400 μg/mL） 4 h. The cell were exposed to 0.1 μg/mL LPS for 20 h. The activity of interleukin 6（IL-6）、10（IL-10） and 1β（IL-1β）， PEG-2 and tumor necrosis factor α（TNF-α） as well as NO by ELISA and an Nitrate acid reductase. The anti-inflammatory effect was evaluated by above method. [Result] Concentration of isocorydine alkaloid in DLF were 15 and 25 μg/mL， which could promote RAW 264.7 cells proliferation significantly （P≤0.05）. Isocorydine alkaloid in DLF increased the secretion of IL-10 and NO as well as reduced IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells. [Conclusion] The anti-inflammatory effectory of isocorydine alkaloid in LDF may be mediated in part of by promoting IL-10 and NO and inhibiting the production of IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α.

Key wordsIsocorydine alkaloid in DLF;RAW 264.7 cells;LPS;Inflammatory factors

紅茂草[Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde，DLF] 罌粟科禿瘡花屬二年生或多年生草本植物，俗稱禿子花、禿瘡花、勒馬回（陜西），主要分布在云南西北部、四川西部、西藏、青海東部、甘肅南部及東南部、陜西秦嶺北坡、山西南部、河南西部、河北西南部，生于海拔400～2 900 m草坡、路邊、田埂、墻頭或屋頂[1]。《陜西中草藥》記載：“味苦、澀、性涼、清熱解毒，消腫，止痛，殺蟲。治扁桃體炎，牙痛，咽喉痛，淋巴結核，禿瘡，瘡癤疥癬，癰疽”[2]。紅茂草生物堿主要包括異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿和百屈菜堿，其中異紫堇堿的含量最高[3]。試驗研究證明，紅茂草素注射液對小鼠脾臟、紅細胞的吞噬功能會產生影響;低劑量紅茂草素注射液（0.2 g/kg）具有促進紅細胞免疫黏附的作用，還能明顯促進脾細胞分泌IL-2，且無劑量依賴關系;而5.0、1.0 g/kg 能使血清溶血素含量升高[4-6]。王廷璞等[7-10]研究發現紅茂草在一定濃度范圍內對細胞具有毒性作用，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有明顯的抑制作用 。毛愛紅等[11]研究發現紅茂草生物堿對四氯化碳引起小鼠肝臟記性損傷具有很好的保護作用。龔艷妮等[12]研究表明紅茂草注射液可顯著促進荷瘤小鼠胸腺和脾臟淋巴細胞的增殖 。趙強等[13]研究發現紅茂草生物堿具有良好的安全性。紅茂草的異紫堇啡堿、原阿片堿藥理作用已有較廣泛的研究，而異紫堇堿的研究較少，主要集中在抗失血性休克、解痙、抗缺氧作用。

細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要組分之一，其毒性成分主要為類脂質A，感染后會產生毒性反應。在人體免疫系統對抗細菌入侵時，LPS作為重要的抗原分子被抗原遞呈細胞（APC）捕獲，從而引起機體的免疫反應。體內免疫細胞如巨噬細胞在LPS誘導下會大量釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子，但是適量的炎癥因子可有利于免疫系統發揮正作用，如果過量就會對機體造成病理損傷，另一方面可能造成促發全身炎癥反應，進一步引發多器官功能衰竭，甚至死亡的后果[14-17]。因此，LPS誘導的RAW 264.7細胞是研究炎癥機制的很好的炎癥細胞模型[18]。

目前關于紅茂草異紫堇堿體外抗炎作用機制的相關研究鮮見報道。因此天水師范學院生物工程與技術學院甘肅省高校農業微生物重點實驗室和免疫學實驗室提取分離純化出紅茂草異紫堇堿，擬采用 LPS 誘使小鼠 RAW 264.7 巨噬細胞活化，建立體外炎癥模型，通過檢測紅茂草異紫堇堿對細胞上清中NO 的分泌量及炎性細胞因子IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α和IL-10 的分泌水平，旨在研究紅茂草異紫堇堿抗炎作用機制，從而判斷紅茂草異紫堇堿在機體外的抗炎效果，為深入研究紅茂草異紫堇堿體外抗炎作用機制打下基礎，也為其臨床應用提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞。RAW 264.7細胞來源于ATCC，由北納聯創生物技術研究院代購。

1.1.2儀器及主要試劑。CK Model 680型酶標儀，日本Bio-Rad公司;紅茂草異紫堇堿由天水師范學院生物工程與技術學院王廷璞研究員提供;LPS為sigma公司產品;IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α試劑盒購自欣博盛生物科技有限責任公司;NO試劑盒購自碧云天;胎牛血清購自gibico;DME/F12培養基購自Hyclon;cck-8 購自碧云天。

1.2方法

1.2.1紅茂草異紫堇堿對RAW 264.7細胞的毒性作用。

RAW 264.7細胞按4 000個/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培養過夜。棄去培養基，每孔加入190 μL DME/F12培養基（含10% FBS），空白組加入10 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL（分別記為1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL組），于二氧化碳培養箱中培養24 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，在二氧化碳培養箱中培養2 h后在OD=450 nm處測定吸光度。各組做3個平行。

1.2.2不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的影響。

RAW 264.7細胞按4 000個/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培養過夜。棄去培養基，每孔加入180 μL DME/F12培養基（含10% FBS），空白組和陰性對照組每孔加入10 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為50、100、200和400 μg/mL（分別記為50、100、200和400 μg/mL組），于二氧化碳培養箱中培養4 h后空白組加入10 μL 的PBS，其余各孔加入10 μL的LPS（終濃度為0.05 μg/mL），與二氧化碳培養箱中培養20 h。取細胞培養液上清，按NO試劑盒說明書測定NO 的濃度。各組做4個平行。

1.2.3不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放細胞因子和PEG-2的影響。

RAW 264.7細胞按6×104個/孔接入96孔板中，0.5 mL/孔，培養過夜。棄去培養基，每孔加入450 μL DME/F12培養基（含10% FBS），空白組和陰性對照組每孔加入25 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為100、200和400 μg/mL（分別記為100、200和400 μg/mL組），于二氧化碳培養箱中培養4 h后空白組加入25 μL的PBS，其余各孔加入25 μL的LPS（終濃度為0.1 μg/mL），于二氧化碳培養箱中培養20 h。取細胞培養上清液，按IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α試劑盒說明書測定IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的濃度。各組做5個平行。

1.3試驗數據處理

所有數據用SPSS 22.0軟件處理，數據以平均值±標準差表示;組間差異采用獨立樣本t檢驗。

2結果與分析

2.1紅茂草異紫堇堿對RAW 264.7細胞活力的影響

CCK-8試劑盒是一種基于WST-8化合物而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的測定。細胞增殖越多越快，則試劑盒反應顏色越深;細胞毒性越大，細胞被抑制增殖，則顏色越淺。由表1可知，紅茂草異紫堇堿濃度在1和5 μg/mL時，紅茂草異紫堇堿促進RAW 264.7 細胞增殖效果十分顯著（P≤0.01）;其濃度在15、25 μg/mL時，紅茂草異紫堇堿可顯著促進RAW 264.7細胞增殖（P≤0.05）;紅茂草異紫堇堿在50、100、200、300和400 μg/mL與空白組相比也可促進RAW 264.7細胞增殖（P>0.05）。以上結果表明，紅茂草異紫堇堿能促進RAW 264.7細胞增殖，在較低濃度時促進RAW 264.7細胞增殖效果比較明顯，在高濃度時也可促進RAW 264.7細胞增殖，但沒有低濃度時效果顯著。

2.2不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導RAW 264.7細胞NO釋放的影響

用不同濃度的紅茂草異紫堇堿干預4 h后加入LPS（0.05 μg/mL）共同孵育20 h，用一氧化氮試劑盒檢測細胞培養液中NO的濃度。由表2可知，紅茂草異紫堇堿可顯著促進抗炎因子NO的釋放（P≤0.05），并且隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增加，細胞培養液中NO的濃度也隨之

增高。在細胞內NO可作為信號分子，參與細胞內炎癥信號

轉導的過程，以上試驗結果表明，紅茂草異紫堇堿可能是通過促進NO分子的釋放來抑制細胞發生炎癥反應。

2.3不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放細胞因子和PEG-2的影響

在細胞培養液中加入紅茂草異紫堇堿干預4 h，加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后檢測細胞培養液中細胞因子和PEG-2的濃度。

由表3可知，空白組中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度較低，與陰性對照組相比LPS的加入可十分顯著地促進TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放（P≤0.01）。在200和400 μg/mL的紅茂草異紫堇堿的濃度條件下，可顯著抑制RAW 264.7細胞對TNF-α的釋放（P≤0.05），與陰性組相比，100 μg/mL的紅茂草異紫堇堿也可抑制TNF-α的釋放，但不具有統計學意義（P>0.05）;在100、200和400 μg/mL的紅茂草異紫堇堿濃度條件下，不能顯著降低細胞培養液中IL-1β的濃度（P>0.05），但從變化趨勢分析，當紅茂草異紫堇堿的濃度為400 μg/mL，可以抑制RAW 264.7細胞釋放IL-1β;在200和400 μg/mL的濃度條件下的紅茂草異紫堇堿可顯著抑制RAW 264.7細胞釋放IL-6（P≤0.05，P≤0.01）;與陰性組相比，100 μg/mL濃度條件下的紅茂草異紫堇堿也可抑制IL-6的釋放，但不具有統計學意義（P>0.05）。

紅茂草異紫堇堿濃度在100、200和400 μg/mL 的條件下可顯著促進RAW 264.7細胞釋放抗炎因子IL-10（P≤0.05），隨著其濃度的增大抗炎因子的釋放量也隨之增大;在200和400 μg/mL濃度條件下的紅茂草異紫堇堿可顯著抑制RAW 264.7細胞釋放炎癥因子PEG-2（P≤0.05），其濃度為100 μg/mL時，與陰性對照組相比，紅茂草異紫堇堿也可抑制RAW 264.7細胞釋放PEG-2，但不具有統計學意義（P>0.05）。由此可見，紅茂草異紫堇堿可以抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，且隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增加，抑制作用也表現增強效應。紅茂草異紫堇堿通過促進抗炎因子IL-10和抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和PEG-2的釋放來發揮其抗炎作用。

綜上試驗結果推測，紅茂草異紫堇堿干擾LPS誘導RAW 264.7細胞分泌IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α的釋放，另一方面促進IL-10的釋放和NO的分泌發揮抗炎作用。

3討論與結論

炎癥反應是臨床常見的病理過程，近來有文獻報道核因子-κB（NF-κB）和有絲分裂原激活磷酸激酶（MAPKs）的激活可以調節炎性因子[19-21]，并且炎癥過程中細胞會產生一系列因子可能會影響線粒體功能[22-23]。除此之外，脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分也能夠誘導機體全身性炎癥反應，在體外常用于刺激免疫細胞來篩選抗炎藥物[24]。

LPS刺激RAW 264.7細胞后，可誘導其產生誘導性一氧化氮合成酶，進而合成大量的NO氣體分子。在免疫性炎癥發病進程中，體內NO 水平升高可從多個途徑影響病理進程[25-26]，NO是具有生物氣體分子，濃度的變化可調節細胞內信息的傳遞，在免疫應答中發揮很重要的作用[27-28]。該研究發現紅茂草異紫堇堿濃度在1～400μg/mL時，對RAW 264.7 細胞無毒害作用。紅茂草異紫堇堿可通過促進NO的釋放從而起到抗炎作用，隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增大，在細胞培養液中NO的濃度也隨之增大。

LPS能夠誘導RAW 264.7細胞分泌炎性因子，如NO、IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α等[29]。在正常水平下它們參與機體的免疫調節、發揮抗感染的作用。但是隨著這些炎癥因子在體內的濃度增大，它們可刺激免疫細胞和非免疫免疫細胞釋放多種細胞因子（如IL-18、E-選擇素和ICAM-1等），從而擴大炎癥反應。IL-10是一種抗炎因子，主要通過活化巨噬細胞來發揮其抗炎作用;IL-6在獲得性免疫和先天性免疫中發揮重要的作用，它通過調節T細胞的活性在慢性炎癥中發揮重要的作用;IL-1β作為一種促炎因子，主要在炎癥反應初期發揮作用，IL-1β通過旁分泌和自分泌的方式誘導其他促炎因子的產生，并誘導中性粒細胞向炎癥部位聚集，從而加重組織的炎癥反應;TNF-α是由單核-巨噬細胞分泌的一種細胞因子，在炎癥反應中起主要的作用;PEG-2在體內是一種重要的促炎因子，IL-1β刺激細胞產生并向炎癥部位聚集，進一步對組織造成損傷[29]。