不同酸化劑對(duì)常見致病菌的體外抑菌效果研究

朱曉萍 莊智威 崔英杰 陳冠何 尚秀國(guó)

摘要??采用瓊脂平板打孔法、試管二倍稀釋法和平板培養(yǎng)法，進(jìn)行了8種單一酸化劑對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)菌和1株臨床分離菌（大腸桿菌）的體外抑菌效果觀察。結(jié)果表明，8種單一酸化劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、金色葡萄球菌、沙門氏菌及臨床分離大腸桿菌株具有不同程度的抑菌作用，其中甲酸、富馬酸和酒石酸抑菌活性最強(qiáng)，乳酸、蘋果酸和檸檬酸相對(duì)最弱。

關(guān)鍵詞??酸化劑;有害菌;最小抑菌濃度;最小殺菌濃度

中圖分類號(hào)??S??816.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

文章編號(hào)??0517-6611（2020）04-0078-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Antibacterial Effects of Different Acidifying Agents on Common Pathogenic Bacteria in vitro

ZHU Xiao-ping，ZHUANG Zhi-wei， CUI Ying-jie et al??（School of Life Science and Engineering，F(xiàn)oshan University， Foshan， Guangdong 528231）

Abstract??The antibacterial effects ?of ?eight ?kinds of single acidifying agents on three standard strains ，one clinical isolation of E. coli in vitro were observed by using agar diffusion plate method， test tube double dilution method and plating culture method. ?The results showed that ?eight kinds of acidifying agents had different ?antimicrobial effects on standard E. coli， ?Staphylococcus aureus and Salmonella，and clinical isolation of E. coli. The antibacterial activity of formic acid， fumaric acid and tartaric acid were the strongest， ?and the antibacterial activity of lactic acid， malic acid and citric acid were the weakest.

Key words??Acidifying agents;Harmful bacteria;Minimal inhibitory concentration;Minimal bactericidal concentration

酸化劑作為一種無殘留、無抗藥性、無毒害作用的環(huán)保型添加劑，不僅具有抑菌作用，而且還能有效降低飼料在消化腸道內(nèi)的pH，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，增強(qiáng)機(jī)體生物免疫力，緩解應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)具有改善動(dòng)物飼料的適口性，增加畜禽的采食量，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)等功能[1-6]。筆者采用瓊脂平板打孔法和二倍稀釋法，研究8種酸化劑對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)菌株（大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌）和1株臨床分離菌（大腸桿菌）的抑菌效果，旨在了解不同單一酸化劑對(duì)致病細(xì)菌的抑菌效果，將酸化劑作為抗生素替代品應(yīng)用于飼料添加劑生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料??甲酸、二甲酸鉀、乳酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸和磷酸。

1.2??試驗(yàn)菌種??大腸桿菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 ATCC 6538、腸沙門氏菌 ATCC9120，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。豬大腸桿菌臨床株來自佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.3??主要儀器和試劑??主要儀器有立式滅菌鍋（YXQ-LS-50S Ⅱ）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2D）、恒溫振蕩器（MX-F）、恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱等;主要試劑有LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MH營(yíng)養(yǎng)固體瓊脂、無菌生理鹽水。

1.4??菌懸液的制備

取活化好的菌株，挑取單菌落接種到3 mL的無菌生理鹽水中，制備菌體懸浮液，使懸浮液中細(xì)菌數(shù)為1×107 CFU/mL。

1.5??抑菌圈直徑的測(cè)定??在無菌條件下取200 μL菌懸液涂布均勻在培養(yǎng)基平板上，用無菌的打孔器在每個(gè)平板上均勻打4個(gè)孔，用移液器將100 μL酸化劑液注入孔內(nèi)。然后，將平板置于37 ?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好后取出并測(cè)定其抑菌圈直徑。

1.6??最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

用滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將8種酸化劑按倍比濃度稀釋配制成終濃度為16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250和0.125 g/L的溶液，并分裝到各試管中，每個(gè)試管2.7 mL。然后將300 μL菌液加入不同濃度的試管中，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)每個(gè)梯度組設(shè)不含酸化劑只含等量菌液的陽(yáng)性對(duì)照管1支以及不含酸化劑也不含菌液的陰性對(duì)照管1支，置于37 ?℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。肉眼觀察證實(shí)無菌生長(zhǎng)試管中的最低酸化劑濃度即為最小抑菌濃度。使用紫外分光光度儀，以空白組作為校準(zhǔn)參照，在580～600 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)4種菌在不同濃度梯度酸化劑中的生長(zhǎng)情況，沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低稀釋濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.7??最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

從各種酸化劑的MIC和高于MIC濃度的各試管中，分別吸取75 μL培養(yǎng)物，接種于瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，肉眼觀察無菌落生長(zhǎng)的最低酸化劑濃度即為最小殺菌濃度。

2??結(jié)果與分析

2.1??8種酸化劑對(duì)致病菌的抑菌作用

由表1可知，在8種酸化劑濃度均為10 mg/mL時(shí)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌和臨床分離大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)的是甲酸，其次是二甲酸鉀，最弱的是磷酸。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)的是二甲酸鉀，其次是酒石酸，最弱的是乳酸。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌的抑菌作用最強(qiáng)的是甲酸，其次是酒石酸，最弱的是磷酸。

2.2??8種酸化劑對(duì)致病菌的最小抑菌濃度??由表2可知，甲酸對(duì)大腸桿菌、臨床分離大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌作用明顯，在0.31 mg/mL濃度以下即可起到抑菌效果。乳酸、富馬酸和酒石酸對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為1.25 mg/mL，同時(shí)富馬酸對(duì)分離大腸桿菌的抑菌濃度也是1.25 mg/mL。檸檬酸、蘋果酸、磷酸和二甲酸鉀對(duì)4種菌的最低抑菌濃度為2.50 mg/mL。另外，6種酸化劑對(duì)臨床分離大腸桿菌的最低抑菌濃度也是2.50 mg/mL。這說明甲酸的抑菌濃度最低，其次為富馬酸，再次為酒石酸和乳酸，其他酸化劑的抑菌濃度較高。

2.3??8種酸化劑對(duì)致病菌的最小殺菌濃度

由表3可知，甲酸對(duì)大腸桿菌的最小殺菌濃度最低，為1.25 mg/mL;其次是富馬酸和酒石酸，最小殺菌濃度為2.50 mg/mL;其余5種酸化劑的最小殺菌濃度均為5.00 mg/mL。甲酸和富馬酸對(duì)臨床分離大腸桿菌的最小殺菌濃度最低，為1.25 mg/mL;其次是酒石酸，為2.50 mg/mL;最弱的是乳酸，最小殺菌濃度為10.00 mg/mL。甲酸對(duì)金色葡萄球菌的最小殺菌濃度最低，為1.25 mg/mL，其次是富馬酸和酒石酸，最弱的是乳酸、檸檬酸和蘋果酸。甲酸對(duì)沙門氏菌的最小殺菌濃度最低，為1.25 mg/mL;其次是乳酸、富馬酸和酒石酸，最弱的是乳酸和檸檬酸濃度是10.00 mg/mL。這說明在所有單一酸化劑中甲酸的殺菌濃度最低，其次為富馬酸和酒石酸，其他酸化劑的殺菌濃度均較高。

3??討論

大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌是引起畜禽的疾病，在生產(chǎn)中流行范圍廣、發(fā)病率和死亡率高，給畜禽的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。無機(jī)酸化劑在體內(nèi)可完全解離酸根離子和氫離子，而氫離子通過降低病原菌細(xì)胞的滲透壓體系，抑制病原菌的生長(zhǎng)。

該研究結(jié)果表明，8種單一酸化劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、金色葡萄球菌、沙門氏菌及臨床分離大腸桿菌株具有不同程度的抑菌作用，其中甲酸、富馬酸和酒石酸抑菌活性最強(qiáng)，乳酸、蘋果酸和檸檬酸則相對(duì)最弱。馬鑫等[7]研究表明，蛋氨酸羥基類似物和乳酸、甲酸、二甲酸鉀對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌都有抑菌作用，與該試驗(yàn)結(jié)果相一致。張嚴(yán)等[8]研究表明苯甲酸、山梨酸、檸檬酸、蘋果酸和富馬酸等對(duì)大腸桿菌和金色葡萄球菌均有抑制效果。Cornowicz[9]在飼料中添加乳酸、丙酸、蘋果酸飼喂肉雞，發(fā)現(xiàn)不同酸化劑均可以降低糞便中嗜溫細(xì)菌和真菌的數(shù)目，顯著降低了墊草中大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量。Brahma[10]研究表明在飼料中添加乳酸、蘋果酸、丙酸可以提高奶牛對(duì)疾病的抗耐受能力。

有機(jī)酸的抑菌機(jī)制可能是一方面解離出氫離子，產(chǎn)生氫離子效應(yīng);另一方面，小分子有機(jī)酸可透過細(xì)胞壁進(jìn)入病原菌細(xì)胞內(nèi)，抑制DNA和RNA的合成，進(jìn)而起到抑菌和殺菌作用。但有關(guān)這方面的研究較少，尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] BURNELL T W，CROMWELL G L，STATHLY T S.Effects of dried whey and copper sulfate on the growth responses to organic acid in diets for weanling pigs[J].J Anim Sci，1988，66（5）：1100-1108.

[2] VERSTEEGH H A J，JONGBLOED A W.Lactic acid has a positive effect on broiler performance [J]. World poultry， 1999，15（8）：16-17.

[3] 石寶明，單安山.飼用酸化劑的作用與應(yīng)用[J].飼料工業(yè)，1999，20（1）：3-5.

[4] LUCKST C.Effects of organic acids in animal nutrition：Alternatives for feed safety and animal health[J]. Kraftfutter feed magazine，2003，88（11/12）：370-372.

[5] 黃凱.抗菌型酸化劑的體外篩選及替代抗生素對(duì)肉仔雞飼喂效果的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[6] 雒秋江，朱文濤，楊開倫，等. 添喂四種酸化劑對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能和日糧表觀利用率影響的比較[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，41（1）：1-5.

[7] 馬鑫，馬秋剛，計(jì)成，等. 蛋氨酸羥基類似物和有機(jī)酸化劑對(duì)主要腸道病原菌體外抑菌效果的比較[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20（2）：238-241.

[8] 張嚴(yán)，胡松華，張玲玲，等.不同酸化劑的抑菌效果研究[J].飼料研究，2018（2）：1-4，21.

[9] GORNOWICZ E.Microbiological evaluation of poultry house environments as influenced by acidifying preparations added to compound feed[J]. Medycyna weterynaryjna，2004，60（7）：755-758.

[10] BRAHMA B.Effect of acidifier supplementation on growth performance and health of crossbred calves[J]. Indian journal of dairy science，2004，57（4）：279-281.