重組人促紅細胞生成素對大鼠急性脊髓損傷后炎癥因子表達及運動功能的影響

吳海峰 胡治平 趙慧毅 華強 謝柏臻 張仕開

【摘要】 目的 研究重組人促紅細胞生成素（rhEPO）對大鼠急性脊髓損傷（SCI）后腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達及運動功能的影響， 探討其減輕脊髓損傷、保護神經功能的可能機制以及對運動功能恢復的影響。方法 36只SD大鼠， 采用隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、脊髓損傷組（SCI組）、治療組（EPO組）， 每組12只。Sham組：不損傷脊髓， 僅行椎板切除術;SCI組和EPO組：行椎板切除術后， 均采用改良的Allen's撞擊法造成脊髓損傷。EPO組于術后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO;Sham組及SCI組， 于術后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔內注射等量的0.9%氯化鈉溶液。術后第3天， 各組分別處死6只大鼠并取材， 用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測 TNF-α、IL-1β 、IL-6 的表達水平;并用脊髓損傷Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法評價大鼠術后第1、3、7、14 天的運動功能情況。比較三組脊髓組織中各炎癥因子表達情況及不同時間點BBB評分。結果 術后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。BBB評分最高分21分， Sham組無脊髓損傷， 術后大鼠運動功能正常， BBB評分接近正常值。術后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評分隨著時間的延長而升高， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。術后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評分均低于Sham組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。術后第7、14天， EPO組大鼠的BBB評分分別為（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI組（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。結論 rhEPO可減少急性脊髓損傷后炎癥因子TNF-α、IL-1β 、IL-6的表達， 減輕炎癥反應， 從而發揮保護神經的作用;且rhEPO 可明顯改善脊髓損傷后大鼠的運動功能， 有利于神經功能的恢復。

【關鍵詞】 脊髓損傷;重組人促紅細胞生成素;炎癥因子;運動功能

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.093

【Abstract】 Objective? ?To investigate the effects of recombinant human erythropoietin （rhEPO） on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6（IL-6） and motor function after acute spinal cord injury （SCI） in rats， and to explore the possible mechanism of its reduction of spinal cord injury and protection of nerve function， as well as its effect on the recovery of motor function. Methods? ?A total of 36 SD rats were divided into sham-operated group （Sham group）， spinal cord injury group （SCI group） and treatment group （EPO group） by random number table method， with 12 rats in each group. Sham group： no spinal cord injury， only laminectomy; SCI group and EPO group： after laminectomy， modified Allen's impact method was used to cause spinal cord injury. EPO group was intraperitoneally injected with rhEPO 1 h， 1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. In the Sham group and SCI group， the same amount of 0.9% sodium chloride solution was injected intraperitoneally 1 h，?1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. On 3rd day after operation， 6 rats in each group were killed and sampled， and the expression levels of TNF- α， IL-1β and IL-6 were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The exercise function of rats on the 1st， 3rd， 7th and 14th days after operation was evaluated by spinal injury Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） score. The expression of inflammatory factors and BBB scores at different time points in the three groups were compared. Results? ?At 3rd day after operation， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in Sham group was lower than those in SCI group and EPO group， and EPO group was lower than SCI group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The highest BBB score was 21 points. There was no spinal cord injury in the Sham group. The postoperative rats had normal motor function， and BBB score is close to normal. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， BBB scores of EPO group and SCI group increased with time， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group and SCI group were lower than those of sham group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group were （10.04±1.01）， （12.50±1.17） points respectively， which were higher than those of SCI group （7.92±1.04）， （9.92±1.12） points. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?RhEPO can reduce the expression of inflammatory factors TNF-a， IL-1β and IL-6 after acute spinal cord injury， and reduce the inflammatory response， thereby playing a neuroprotective role.? rhEPO can significantly improve the motor function of rats after spinal cord injury and is beneficial to the recovery of nerve function.

【Key words】 Spinal cord injury; Recombinant human erythropoietin; Inflammatory factors; Motor function

脊髓損傷是脊柱骨折脫位中常見而嚴重的損傷， 不僅給患者帶來嚴重的身心傷害， 也給社會帶來巨大經濟負擔。目前臨床上對脊髓損傷的治療效果欠佳， 對脊髓損傷后炎癥作用機制了解較少。近年來， 促紅細胞生成素（EPO）已被證明在神經退行性疾病、神經元死亡相關的損傷和其他疾病的各種體內外模型中具有保護作用[1]。Okutan等[2]的研究表明， EPO具有抗細胞凋亡和抗炎的作用， 可顯著改善大鼠的早期運動功能。本實驗旨在通過建立大鼠的SCI撞擊模型， 觀察rhEPO對大鼠SCI后TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平及運動功能的影響， 探討其減輕脊髓損傷、保護神經功能的可能機制以及對運動功能恢復的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 大鼠來源 36只SD大鼠（SPF級， 體重220～250 g）， 由廈門大學實驗動物中心提供。大鼠飼養條件為：室溫20～25 ℃，?光照和黑暗持續時間為12 h， 可隨意獲取水和食物。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（Sham組）、脊髓損傷組（SCI組）、治療組（EPO組）， 每組12只。

1. 2 方法 Sham組：不損傷脊髓， 僅行椎板切除術;SCI組及EPO組：行椎板切除術后， 均采用改良的Allen's撞擊法造成脊髓損傷。EPO組于術后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO（按照5000 U/kg注射）;Sham組及SCI組于術后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔內注射等量的0.9%氯化鈉溶液。實驗開始前， 大鼠經腹腔注射1.5 %戊巴比妥鈉麻醉后（40 mg/kg）， 取俯臥位， 將大鼠固定于無菌操作臺上， 背部剃毛， 消毒后鋪無菌洞巾， 以T10棘突為中心作一長約3 cm的正中切口， 依次分離各層組織， 顯露T9～T11的上下棘突及椎板， 用咬骨鉗咬除T10棘突及雙側椎板， 使硬脊膜充分暴露。然后用自制的改良Allen's裝置， 造成T10脊髓的急性挫傷。（在硬脊膜表面放置一個與其彎曲度一致的塑料墊片， 墊片上垂直放置一個帶有刻度的玻璃管， 讓重量為10 g的圓柱狀金屬棒， 在玻璃管的引導下， 從刻度3 cm的高度垂直下落， 使其撞擊墊片， 造成致傷力為30 gcf的脊髓損傷。）隨即大鼠出現身體顫抖， 尾巴痙攣性擺動， 雙下肢迅速回彈， 術后大鼠出現雙側后肢軟癱， 肌張力消失， 損傷平面以下對刺激無反應， 提示SCI模型制備成功。操作完成后， 用0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口并逐層縫合， 術后所有大鼠飼養條件同前。脊髓損傷后， 每只籠飼養2只大鼠， 按壓大鼠膀胱3次/d， 直至恢復排尿功能。各組術后第3天完成BBB評分后， 分別處死6只大鼠， 沿原切口取出以 T10節段為中心長約1.5 cm的傷段脊髓， 保存于液氮中備用。

1. 3 觀察指標及判定標準

1. 3. 1 各炎癥因子的表達情況 rhEPO注射液購自沈陽三生制藥有限公司， TNF-α、IL-1β、IL-6 的ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司。檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的表達情況， 采用ELISA法， 嚴格按照說明書步驟操作。

1. 3. 2 BBB評分 參照Basso等提出的BBB評分法進行評分， 滿分21分[3]。評分由2名非本組但熟悉 BBB 評分的研究人員進行， 術后第1、3、7、14天對每只大鼠進行BBB評分（術后第1、3天各組隨機抽取6只大鼠進行評分， 以保證各時間點評分的大鼠數量一致）， 雙人獨立觀察， 主要觀察大鼠行走步態以及四肢關節的協調性。觀察時間≥4 min/次， 最終取平均值。

1. 4 統計學方法 采用SPSS25.0統計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 多組比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 三組脊髓組織中各炎癥因子表達情況比較 術后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組，?差異均具有統計學意義（P<0.05）， 說明EPO可以明顯減少脊髓損傷后炎癥因子的表達。見表1。

2. 2 三組大鼠不同時間點BBB評分比較 BBB評分最高分21分， Sham組無脊髓損傷， 術后大鼠運動功能正常， BBB評分接近正常值。術后第1、3、7、14天， EPO組和SCI組大鼠的BBB評分隨著時間的延長而升高， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。術后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評分均低于Sham組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。

術后第7、14天， EPO 組大鼠的BBB評分均高于SCI組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

脊髓損傷的機制包括即刻的機械損傷（原發性損傷）和隨之發生的血管、生化反應所致的繼發性損傷。其中繼發性損傷階段其病理生理機制涉及血管功能障礙、水腫、局部缺血、興奮性毒性、電解質移位、自由基產生、炎癥和延遲的凋亡性細胞死亡[4]。研究表明， 炎癥反應在脊髓繼發性損傷中起重要作用[5]。

在炎癥反應中， TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子具有促進炎癥反應的進展， 加重脊髓繼發性損傷的作用， 其主要病理機制包括[3]：①炎癥因子激活一系列的炎癥反應加重脊髓組織的水腫和壞死;②炎癥因子刺激膠質細胞增殖， 形成瘢痕;③TNF-α通過與其受體結合觸發凋亡信號轉導， 導致神經元凋亡;④炎癥因子通過正反饋機制增強NF-B（核因子B）的表達， 從而形成級聯放大效應， 進一步促進TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達。Zhou等[6]通過研究表明， EPO可以降低受損腦組織中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的表達， 減少中性粒細胞和分化簇3（CD3）+T細胞在腦組織中的浸潤和活化， 增加抗炎細胞因子白細胞介素-10（IL-10）的表達， 從而調節炎癥反應， 改善神經和認知功能。本文實驗中顯示， 術后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）， 說明EPO可以明顯減少脊髓損傷后炎癥因子的表達。說明rhEPO可能通過抑制脊髓損傷后 TNF-α、IL-1β、IL-6的表達， 減輕炎癥反應， 從而改善神經功能。

EPO是一種在神經保護中具有新興作用的細胞因子。EPO通過降低谷氨酸毒性， 增加抗細胞凋亡因子的產生， 減少炎癥和通過直接和間接抗氧化作用減少一氧化氮介導的損傷來促進中樞神經系統（CNS）損傷后的神經再生。Noguchi等[7]通過大鼠脊髓損傷模型發現EPO對大鼠神經根撕脫傷后脊髓運動神經元具有神經保護作用。Simon等[8]在兔的脊髓缺血/再灌注損傷模型上證實EPO可減輕神經細胞損傷和凋亡， 且有助于運動功能的恢復。本實驗中， BBB評分最高分21分， Sham組無脊髓損傷， 術后大鼠運動功能正常， BBB評分接近正常值。術后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評分隨著時間的延長而升高， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。術后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評分均低于Sham組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。術后第7、14天， EPO 組大鼠的BBB評分分別為（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI組（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。說明rhEPO 可明顯改善脊髓損傷后大鼠的運動功能， 有利于神經功能的恢復。

總之， 本研究為EPO的神經保護作用提供了一定的實驗證據， 但是， 由于繼發性脊髓損傷涉及的機制繁多復雜， 因此仍然需要大量更深入的研究去揭示其本質。鑒于EPO誘導的神經保護作用越來越多， 相信在不遠的將來EPO很可能成為臨床上治療脊髓損傷的有效治療方法。

參考文獻

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[2] Okutan O， Solaroglu I， Beskonakli E， et al. Recombinant human erythropoietin decreases myeloperoxidase and caspase-3 activity and improves early functional results after spinal cord injury in rats. Journal of Clinical Neuroscience， 2007， 14（4）：364-368.

[3] 李基民， 權正學， 劉渤. 核轉錄因子-κB 信號途徑與急性脊髓損傷繼發傷的研究進展. 創傷外科雜志， 2009， 11（1）：85-87.

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[6] Zhou ZW， Li F， Zheng ZT， et al. Erythropoietin regulates immune/inflammatory reaction and improves neurological function outcomes in traumatic brain injury. Brain and behavior， 2017， 7（11）：e00827.

[7] Noguchi T， Ohta S， Kakinoki R， et al. The neuroprotective effect of erythropoietin on spinal motor neurons after nerve root avulsion injury in rats. Restorative neurology and neuroscience， 2015， 33（4）：461-470.

[8] Simon FH， Erhart P， Vcelar B， et al. Erythropoietin preconditioning improves clinical and histologic outcome in an acute spinal cord ischemia and reperfusion rabbit model. Journal of vascular surgery， 2016， 64（6）：1797-1804.

[收稿日期：2019-11-22]