應用MTT法對惡性腫瘤原代細胞培養進行規范化體外藥敏試驗的研究

李恒善 云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇

【摘要】 目的 探究應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法對惡性腫瘤原代細胞培養進行規范化體外藥敏試驗的可行性和實用性。方法 30例惡性腫瘤患者的新鮮腫瘤組織， 進行原代細胞培養純化。采用MTT比色法規范化檢測12種腫瘤化療藥物對人惡性腫瘤原代細胞培養進行體外藥敏試驗。結果 紫杉醇、多西他賽對胃癌和結直腸癌原代培養細胞的藥物敏感性均為77.78%， 而對乳腺癌原代培養細胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養細胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。結論 MTT法對于臨床合理用藥， 實現腫瘤患者的個體化化療具有重要的價值。

【關鍵詞】 四甲基偶氮唑鹽比色法;惡性腫瘤;藥敏試驗;化療

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.094

MTT法為一種用于檢測細胞生長和存活的方法[1， 2]， 主要是通過測定活細胞內線粒體能量代謝過程中的脫氫酶將MTT代謝還原為不溶性紫色的甲簪沉淀產物， 而死細胞不著色[3， 4]。通過MTT染色及個性化篩選， 為臨床更好的使用化療藥物對惡性腫瘤細胞進行化療治療提供參考依據。本研究將對MTT法進行系統性的研究。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2018年6月～2019年5月行初次手術的30例惡性腫瘤患者作為研究對象。其中， 男22例， 女8例;年齡26～72歲， 平均年齡（52.6±8.87）歲;乳腺癌12例， 胃癌9例， 結直腸癌9例。

1. 2 方法

1. 2. 1 化療藥物的配制 分別選取紫杉醇、多西他賽、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、氟尿嘧啶、吉西他濱、長春瑞濱、依托泊苷12種常見化療藥物， 均為臨床用注射針劑， 用腫瘤細胞選擇性培養基配制。配好的實驗藥物置于-20℃保存， 應用時需提前放置室溫。

1. 2. 2 惡性腫瘤組織的取材 選取患者的新鮮腫瘤組織， 取材時應避開破潰、壞死及液化部分， 以防污染。每例標本應于離體后5～20 min內取材， 要求標本直徑約0.5～1.0 cm， 剩余腫瘤組織用于病理， 取材后經無菌生理鹽水沖洗后立即置無菌DHanks液中（保證腫瘤組織濕潤及營養）帶回實驗室， 并于30 min內進行分離培養。

1. 2. 3 惡性腫瘤細胞的培養純化 于超凈工作臺內取出標本， 去除腫瘤組織周圍的脂肪、血管、纖維和壞死組織， 然后用平衡至常溫的DHank s液漂洗2～3遍至無血跡同時沖去廢棄組織。以手術刀和眼科剪迅速將標本剪碎呈糊狀（大小約為1～2 mm3）。用消化培養法進行原代細胞培養， 加入0.25%的胰蛋白酶， 37℃條件下消化20 min后用含有血清的培養基終止消化， 離心棄去上清， 磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。

應用振蕩法使細胞充分散開， 經200目（直徑0.76 mm）不銹鋼無菌濾網過濾， 棄去脂肪和較大的未解離組織。將最終收獲的腫瘤細胞置入25 cm2細胞培養瓶中。應用腫瘤細胞選擇性培養基在37℃， 5% CO2飽和濕度培養箱內進行培養純化。

1. 2. 4 惡性腫瘤細胞MTT法藥敏試驗 將培養純化得到的惡性腫瘤細胞， 制成細胞懸液， 調整細胞濃度為106/ml待用。本試驗根據所要檢測的化療藥物種類分為多個治療組， 另設一個陰性對照組和空白對照組， 每組復置3孔。具體加樣情況如下：治療試驗組：腫瘤細胞懸液100 μl/孔+化療藥物10 μl/孔+腫瘤細胞選擇性培養基90 μl/孔（藥物終濃度為體內血漿高峰濃度10倍）;陰性對照組：腫瘤細胞懸液

100 μl/孔+腫瘤細胞選擇性培養基100 μl/孔;空白對照組：腫瘤細胞選擇性培養基200 μl/孔;將加好樣的96孔無菌培養板， 置37℃、5%的CO2飽和濕度培養箱中培養48 h后， 每孔中加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl， 上述條件繼續培養4 h， 離心棄上清， 再加甲臜溶劑三聯液100 μl， 于37℃放置過夜， 待甲臜結晶徹底溶解后， 在酶標儀上比色， 測出每孔在波長570 nm波長處吸光度A值。藥物對腫瘤細胞的抑制率=[1-（治療試驗孔平均A值/陰性對照孔平均A值）]×100%。抑制率>50%為高度敏感， 抑制率30%～50%為中度敏感， 抑制率<30%為耐藥。

2 結果

紫杉醇、多西他賽對胃癌和結直腸癌原代培養細胞的藥物敏感性均為77.78%， 而對乳腺癌原代培養細胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養細胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。見圖1。

3 討論

惡性腫瘤治療采取化療方案的個體化一直是臨床工作中的一個難題， 因此， 科研人員不斷經過摸索建立了多種腫瘤藥物化療的藥敏檢測方法[5]。MTT法具有多種優點， 為目前進行腫瘤藥敏試驗最有效的方法之一[6， 7]。

MTT法可有效反映腫瘤細胞對化療藥物的敏感性， 與臨床療效的相關性較好。然而， MTT方法也存在局限性， 其尚未有一個公認的統一技術順序[8]。因此， 本研究主要對MTT方法學進行系統研究， 針對該方法操作的各環節如細胞濃度、受試藥物濃度、細胞培養時間、MTT培養時間等進行合理優化和選擇， 進而確定本實驗室的MTT法規范化操作流程。通過MTT法對人惡性腫瘤原代培養細胞進行規范化體外藥敏試驗發現， MTT法可較準確的反映不同腫瘤患者對12種不同腫瘤化療藥物的敏感性差異別， 其檢測結果與臨床療效具有較好的吻合性。此外， 與以往傳統腫瘤藥敏試驗相比， 本研究在腫瘤原代細胞培養純化方面進行了明顯改進， 可大量減少成纖維細胞及人體其他正常組織成分對藥敏試驗的干擾， 具有一定創新性。

綜上所述， 本研究通過MTT法對惡性腫瘤原代細胞培養進行規范化體外藥敏試驗， 確定了該試驗的操作流程。

參考文獻

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[收稿日期：2019-05-21]