CCAAT 增強子結合蛋白δ 在前列腺癌進展及預后中的作用

凌濟忠張玉婷習明萬頌華偉江敏耀萬躍平

（1.廣州市花都區花山鎮衛生院外科，廣東 廣州510880； 2.廣州醫科大學南山學院南山班，廣東 廣州511436； 3.南方醫科大學花都區人民醫院泌尿外科，廣東 廣州510800）

前列腺癌是全球46 個國家男性癌癥死亡的主要原因［1］。 2019 年美國預計將新增174 650 例前列腺癌患者，位居男性癌癥發病率第1 位，同時預計新增31 620 例前列腺癌死亡患者，位居男性癌癥死亡率第2 位［2］。 為了防止過度診斷和過度治療，前列腺特異性抗原篩查在逐年減少，從而使前列腺癌發病率逐年下降，但是晚期診斷同時在逐年增加。 目前正面臨著缺乏在早期診斷中高危、致死性前列腺癌的手段，又能防止過度診斷和過度治療的嚴峻挑戰。 CCAAT ／增強子結合蛋白δ（CEBPD）是一種轉錄因子，涉及一系列的生理過程，如細胞分化、代謝、炎癥、生長停滯和細胞死亡［3］。 近年來，有許多研究表明CEBPD 與癌癥的進展相關，如白血病［4］、肝細胞 癌［5］、乳 腺 腫 瘤［6］、尿 路 上 皮 癌 等［7］。 然 而，CEBPD 在前列腺癌中的表達情況及CEBPD 在前列腺癌進展和預后方面的作用的報道較少。 本研究使用免疫組織化學檢測CEBPD 在前列腺癌組織中的表達情況，結合Taylor 數據庫分析CEBPD 表達水平與患者臨床病理特征和生存期的關系，探討CEBPD在前列腺癌進展和預后中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

前列腺癌及正常組織組微陣列芯片購買自西安艾麗娜生物科技有限公司（Cat No：PR807a），包含正常組織3 例，邊緣組織7 例，腺癌組織50 例，增生組織20 例。 研究生存曲線的數據來源于Taylor 數據庫，包含150 例前列腺癌和29 例癌旁組織（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／query／acc.cgi？acc ＝GSE21032）。

1.2 實驗方法

免疫組織化學實驗： 按照邁新生物技術UltraSensitiveTMSP IHC 試劑盒（Cat. No：KIT-0305）說明進行免疫組化染色，55 ℃烘烤組織芯片1 ，二甲苯、酒精梯度脫蠟，封閉內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽抗原修復，血清封閉，一抗CEBPD（1 ∶40；博奧森，Cat No：bs-13821R）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，三抗室溫孵育15 min，DAB 試劑盒顯色，蘇木素鹽酸復染細胞核。 芯片染色結果根據強度和范圍進行評估，染色強度分為0、1、2、3 共4 個等級，染色范圍分為0（0 ～5%）、1（6% ～25%）、2（26% ～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）5 個等級，最終得分為染色強度與染色范圍之和。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學處理。 計量資料以±s表示，數據比較采用獨立樣本t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 檢驗，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌組織芯片中CEBPD 表達的檢測

在前列腺癌組織芯片中，利用免疫組織化學實驗檢測CEBPD 蛋白的表達水平，結果可見前列腺癌組織中CEBPD 蛋白染色主要位于細胞質中，染色強度為弱陽性或陽性。 染色強度定量分析結果顯示，正常前列腺組織和前列腺癌組織中CEBPD 染色評分分別為2.96±1.72 和3.70±1.40，其差異無統計學意義（P＝0.056）（見表1）。 但是在前列腺癌患者中，Gleason 評分＜8 的癌組織中的CEBPD 染色評分高于Gleason 評分≥8 的癌組織（P＝0.032）（見圖1）。

圖1 前列腺癌組織芯片中CEBPD 的檢測結果Figure 1 Detection results of CEBPD in prostate cancer tissue microarray

2.2 CEBPD 表達與前列腺癌患者臨床病理特征的關系

通過前列癌組織芯片的臨床數據資料，探索CEBPD 蛋白表達水平與臨床病理特征的關系，結果顯示CEBPD 表達與Gleason 評分（P＜0.032）相關，同時結合Taylor 公共數據庫分析，發現CEBPD 表達與患者的年齡（P＝0.041）、Gleason 評分（P＜0.01）、臨床分期（P＝0.018）、是否轉移（P＜0.01）、是否死亡（P＝0.029）、是否生化復發（P＜0.01）呈負相關（見表1）。

表1 前列腺癌患者CS 表達與臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between CS expression and clinicopathological features of prostate cancer patients

2.3 CEBPD 在Taylor 數據庫中的生存曲線統計

通過Taylor 公共數據庫探索CEBPD 的表達與前列腺癌病人的生存期的關系，以CEBPD基因表達量的中位數為界線分為高表達組和低表達組，CEBPD 低表達病人的無生化復發生存率比CEBPD高表達病人的生存率低（P＜0.01），總體生存率兩組差異無統計學意義（P＝0.227）（見圖2）。

2.4 CEBPD 在Taylor 數據庫中的COX 回歸分析統計

基于CEBPD 在Taylor 數據庫中的無生化復發生存曲線有統計學差異的基礎上，進一步建立COX回歸模型，分析單因素和多因素的條件下，CEBPD與無生化復發生存率的相關性。 結果顯示，在單因素分析和多因素COX 回歸生存分析中，CEBPD 高表達與前列腺癌患者的生化復發呈負相關（單因素：P＜0．01；多因素：P＝0.032）（見表2）。

圖2 Taylor 數據庫中CEBPD 的生存曲線分析Figure 2 Survival curve of CEBPD in Taylor database

表2 前列腺癌患者的無生化復發COX 回歸分析與臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between non-BCR COX regression and clinicopathological features in patients with prostate cancer

3 討論

CEBPD 屬于CCAAT ／增強子結合蛋白家族，與其余4 個家族成員一起作為轉錄因子起調節細胞生物過程的作用，包括細胞分化、運動、生長停滯、增殖和死亡。 CEBPD 在正常生理條件下以相對低的水平表達，并且被多種細胞外刺激上調，例如白細胞介素-6，脂多糖，白細胞介素-1β，腫瘤壞死因子α，干擾素-α和干擾素-γ。 CEBPD 的過表達可誘導癌細胞生長停滯和凋亡［5］。 此外，在Cebpd-／-／HER2／neu小鼠中觀察到乳腺腫瘤多樣性的增加［6］。 這些結果表明CEBPD 可能是腫瘤抑制因子。 與炎癥反應轉錄因子NF-κB 和STAT3 不同，它們在腫瘤發生后一直被激活，CEBPD 的失活已經在許多癌癥中被觀察 到，包 括 肝 癌，乳 腺 癌 和 白 血 病［5，8-10］。 但 是CEBPD 作為抑癌基因的作用并不普遍，對于尿路上皮癌CEBPD 拷貝數擴增和過表達可能與預后不良和促進腫瘤轉移有關［11］。 基于上述看似矛盾的研究發現，根據腫瘤的類型或者細胞的來源，CEBPD可能與更好或更差的預后相關聯，但要證實其在特定類型癌癥中的真正作用還需要進一步的研究。

本研究通過免疫組化染色前列腺癌組織芯片發現，在該芯片中CEBPD 在前列腺良性組織和前列腺癌組織中的表達沒有顯著差異，有可能是因為良性組織例數過少，存在抽樣誤差。 但是在前列腺癌患者中，Gleason 評分＜8 的癌組織中的CEBPD 表達水平高于Gleason 評分≥8 的癌組織，說明在前列腺癌中CEBPD 可能作為抑癌基因發揮作用。 其次，在Taylor 公共數據庫的分析中，發現CEBPD 表達與患者的年齡、Gleason 評分、臨床分期、是否轉移、是否死亡、是否生化復發呈負相關，同時CEBPD 高表達的前列腺癌患者的無生化復發生存率增高。 結合COX 回歸模型，單因素分析提示提示CEBPD、病理分期、Gleason 評分和是否轉移是前列腺癌患者無生化復發生存率的預后因子，而進一步的多因素分析則提示CEBPD、病理分期和是否轉移是前列腺癌患者無生化復發生存率的獨立預后因子，CEBPD 表達高的患者生化復發的風險較小。 上述結果說明，CEBPD 的表達與前列腺癌的進展和預后密切相關。

本研究結果提示CEBPD 表達可能對前列腺癌的臨床預后有預測作用，可以通過檢測CEBPD 表達水平，聯合PSA 檢測、Gleason 評分、病理分期等其他臨床技術，更好地分析和評估癌癥進展的風險和預后，有希望成為一種新的生物標記物。 同時，CEBPD 參與調節細胞生物運動的復雜網絡，CEBPD如何在人前列腺癌中發揮抑癌因子的調控作用還有待進一步的實驗研究。