肝靶向肽-人腫瘤壞死因子融合基因的克隆、可溶性表達及鑒定

佟陳昀顥郭平馬艷

（廣東藥科大學1.公共衛生學院； 2.生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州510006）

人腫瘤壞死因子（human tumor necrosis factor α，TNFα）是一種可直接殺傷腫瘤細胞的細胞因子［1］。 TNFα 在體內單獨應用具有抗腫瘤作用，與IFN、抗癌藥物、高溫療法等聯合應用治療肝癌可增強療效，然而TNFα 生物學功能的復雜性又使其在臨床應用時表現出明顯的毒副作用［2］，如促炎癥效應、高熱、寒戰、嚴重低血壓等，并且即使全身用藥時在人的耐受劑量范圍內，腫瘤內部達不到治療需要的有效濃度，因此嚴重限制了其在腫瘤治療中的進一步應用，所以降低TNFα 的毒副作用或增加其在腫瘤局部的濃度是應用TNFα 抗腫瘤的關鍵。 目前認為TNFα 局部靶向性應用可以在不引起嚴重毒副反應的情況下，將TNFα 在腫瘤組織中富集作用于腫瘤細胞［3］，取得較好的效果，大幅度地降低了TNFα 的用量和毒副作用。

環子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）是覆蓋于瘧原蟲子孢子表面的一種錨定蛋白［4］，其N端I-plus 片段能與肝細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ heparan sulfate proteoglycan，HSPG）發生特異性結合而靶向肝臟［5］。 本課題組前期已成功構建CSP I-plus 修飾的干擾素和內皮抑制素，結果顯示均具有良好的靶向性與生物活性［6-8］。 本實驗通過基因重組技術SOEing PCR 擴增CSP-TNFα融合基因，并構建原核表達載體CSP-TNFα／pET21b 對其進行大腸桿菌原核表達，以期獲得肝靶向肽-人腫瘤壞死因子CSP-NFα 融合蛋白，為下一步研究其生物學活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2 細胞、E． coliDH5α、E． coliBL21（DE3）和質粒pET21b 均為本實驗室保存，TaqDNA 聚合酶、內切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA 連接酶、pMD20-T 購自TaKaRa 公司；第一鏈合成試劑盒購自Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒、DNA 純化回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自Tiangen 公司；Imidazole（咪唑）、TEMED 購自BioRad 公司；酵母提取物和胰蛋白胨購自Oxoid 公司、Anti-6×His 鼠多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG HRP 標記二抗購自Santa cruz 公司；HisTrap Kit 親和層析填料、XK 16／20 層析空柱購自GE healthcare 公司。

1.2 引物的設計

根據NCBI Genbank 公布的TNFα 和CSP I-plus基因序列，用Primer Premier 5.0 生物軟件設計特異性引物P1 ～P4，如表1 所示。 P1、P2 引物擴增TNFα基因，約702 bp，引物P3、P4、P2 擴增CSPTNFα融合基因，不含編碼TNFα 信號肽基因序列，約543 bp。 引物P2 含有無終止子TNFα C 端互補序列和XhoⅠ限制性內切酶位點引物，P3 含有NdeⅠ限制性內切酶位點和編碼CSP I-plus 19 個氨基酸的部分序列，引物P4 含有與P3 相同序列、編碼CSP I-plus 19 個氨基酸的其余部分序列和編碼無信號肽TNFα N 端序列。 引物由Invintrogen 公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 方法

1.3.1 擴增CSP-TNFα 融合基因提取人肝癌細胞HepG2 總RNA，以P1 和P2 為引物，RT-PCR 擴增TNFα基因，再以TNFα基因序列為模板，以P3、P4、P2 為引物，SOEing PCR 擴增CSP-TNFα融合基因。1%凝脂糖凝膠電泳檢測PCR 結果。

1.3.2 構建重組質粒CSP-TNFα／pMD20-T純化回收CSP-TNFα融合基因的PCR 產物，與pMD20-T 載體連接，并轉化至E．coliDH5α 感受態中進行藍白斑篩選。 挑取白色單菌落進行PCR 鑒定，對PCR鑒定陽性菌株搖菌抽提質粒進行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性菌株送上海Invitrogen 公司進行測序。

1.3.3 構建表達載體CSP-TNFα／pET21bCSPTNFα／pMD20-T 和pET21b 經過雙酶切后膠回收，將獲得的CSP-TNFα 片段和線性化pET21b 連接，并轉化至E．coliDH5α 感受態中進行抗性篩選，挑取單菌落搖菌抽提質粒進行酶切鑒定，將鑒定為陽性菌株送上海Invitrogen 公司進行測序鑒定。

1.3.4 CSP-TNFα 的生物信息學分析利用Prot Param（https：／ ／web.expasy.org／protparam／）分析表達載體中CSP-TNFα 開放閱讀框編碼蛋白的基本參數，包括：氨基酸組成、分子量、理論等電點，在大腸桿菌、哺乳動物和酵母中的半衰期，脂溶性指數及不穩定指數等。

1.3.5 CSP-TNFα 的可溶性表達及鑒定將表達載體CSP-TNFα／pET21b 轉化到E．coilBL21 感受態中，獲得CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 重組菌株，按參考文獻［8］方法，挑取單菌落培養過夜后分別于37 ℃、20 ℃下誘導表達4 h、20 h。 收集菌體超聲裂解，將裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE 和Westernblot 鑒定。

1.3.6 CSP-TNFα 純化將可溶性表達獲得的菌體裂解上清進行Ni-NTA 親和層析純化，方法參照文獻［8］。 CSP-TNFα 融合蛋白C 端有6×His 標簽，可與Ni2＋離子發生特異性結合，吸附在Ni 柱上。 用0%～100%咪唑洗脫，收集洗脫液SDS-PAGE 分析。

2 結果與分析

2.1 CSP-TNFα 融合基因的擴增及鑒定

以HepG2 cDNA 為模板，以P1 和P2 為引物RT-PCR 擴增全長TNFα基因，結果如圖1 所示，在702 bp 處有清晰的目的條帶，與預期大小相符。 以擴增的全長TNFα基因產物為模板，通過引物P3、P4、P2，SOEing PCR 擴增大小為543 bp 的不含編碼TNFα 信號肽序列和終止密碼子的CSP-TNFα融合基因。 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：在約543 bp 處有大小相符的目的條帶，初步判定CSP-TNFα融合基因擴增成功（圖2）。

2.2 重組質粒CSP-TNFα／pMD18-T 鑒定

SOEing PCR 產物純化后進行TA 克隆，對藍白斑篩選結果為白色單菌落進行PCR 鑒定，結果如圖3，在約543 bp 處有特異性條帶。 酶切鑒定發現，與菌落PCR 結果一致，初步判定約543 bp 處條帶為融合基因，在2 000～4 000 bp 之間條帶為pMD20-T載體（圖4）。 測序結果：融合基因含有編碼CSP Iplus 序列、無信號肽和終止密碼子的TNFα 序列，其中TNFα 序列與NCBI：NM＿000594.3 一致，無突變，說明CSP-TNFα融合基因擴增成功。

圖1 RT-PCR 擴增TNFα 基因Figure 1 Amplification of TNFα by RT-PCR

圖2 SOEing PCR 擴增CSP-TNFα 融合基因Figure 2 Amplification of CSP-TNFα by SOEing PCR

圖3 PCR 鑒定CSP-TNFα／pMD20-TFigure 3 Identification of CSP-TNFα／pMD20-T by PCR

2.3 表達載體CSP-TNFα／pET21b 的鑒定

將構建的重組表達載體CSP-TNFα／pET21b 用NdeⅠ和XhoⅠ酶切，得到大小2 個片段，大片段約5 400 bp為pET21b，小片段約543 bp 為CSP-TNFα目的基因（圖5）。 測序結果表明目的基因和表達載體連接方向正確，無基因突變，表明重組表達載體CSP-TNFα／pET21b 構建成功。

圖4 酶切鑒定CSP-TNFα／pMD20-TFigure 4 Identification of CSP-TNFα／pMD20-T by enzyme digestion

圖5 表達載體CSP-TNFα／pET21b 的酶切鑒定Figure 5 Enzymatic identification of CSP-TNFα／pET21b

2.4 融合蛋白CSP-TNFα 的生物信息學分析

如圖6 所示，CSP-TNFα／pET21b 中開放閱讀框編碼含有187 個氨基酸的融合蛋白CSP-TNFα，含有肝靶向肽CSP Ⅰ-plus-人腫瘤壞死因子TNFα-純化標簽6?His，相對分子質量為21 003.89，在大腸桿菌體內的半衰期＞10 h，脂溶性指數為73.13，不穩定指數為32.45，表明CSP-TNFα 穩定好，有利于基因工程表達；兩親指數GRAVY 為-0.494，表明此CSP-TNFα 具有疏水性，有利于分離純化。

2.5 CSP-TNFα 的誘導表達及鑒定

SDS-PAGE 表明，CSP-TNFα／pET21b／BL21 重組菌株37 ℃誘導表達4 h、20 ℃誘導表達20 h 均獲得大小約21 000 蛋白條帶，初步推斷目的蛋白表達成功，其中37 ℃裂解上清中目的蛋白含量少，20 ℃裂解上清中目的蛋白含量較高；Western-blot 鑒定結果：在相對分子質量約21 000 處有特異性蛋白條帶，表明融合蛋白CSP-TNFα 在大腸桿菌表達系統中可溶性表達成功（圖7）。 后續選擇20 ℃誘導20 h進行目的蛋白可溶性表達。

圖6 融合蛋白CSP-TNFα 的氨基酸序列Figure 6 Amino acid sequence of CSP-TNFα

圖7 CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 誘導表達后SDS-PAGE 分析和Western-blot 鑒定Figure 7 Identification of CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 by SDSPAGE and Western-blot

2.6 可溶性CSP-TNFα 的表達純化

CSP-TNFα 可溶性表達產物進行Ni 柱純化，用咪唑洗脫后進行SDS-PAGE，圖8 為融合蛋白純化洗脫峰，圖9 為純化洗脫峰收集液SDS-PAGE，可見在洗脫峰一和洗脫峰二都含有相對分子質量約21 000 特異性蛋白，為目的洗脫峰，并且條帶灰度掃描得出蛋白純度約為97%，說明Ni 柱純化后獲得較純的CSP-TNFα 融合蛋白，下一步可進行生物學活性測定。

圖8 CSP- TNFα 的純化洗脫峰圖Figure 8 Elution peaks of CSP-TNFα

圖9 CSP-TNFα 純化洗脫液SDS-PAGE 分析Figure 9 SDS-PAGE analysis of CSP-TNFα purified eluent

3 討論

瘧原蟲環子孢子蛋白CSP 分布于整個瘧原蟲子孢子表面［12］，研究表明CSPⅠ-plus N 端保守Ⅰ區是瘧原蟲子孢子吸附與入侵肝細胞的關鍵，可與肝細胞表面的HSPG 發生特異性結合［13］，不僅干擾其受體功能，抑制血管形成與細胞增殖［14］，還具有高效而特異的肝細胞靶向性，可作為藥物載體靶向肝臟［15］。 本實驗室通過基因工程技術已成功構建肝靶向肽修飾的人干擾素和重組人內皮抑制素，研究結果顯示其在體內和體外都能較好地靶向肝細胞，并對其生物活性和靶向機制進行了初步研究。 人腫瘤壞死因子是迄今為止人們發現抗腫瘤活性最強的細胞因子［9］，但其較強的毒副作用以及難以在腫瘤細胞局部形成高濃度TNFα 發揮抗癌作用，限制了在臨床上的應用。 據文獻報道靶向性多肽作為導向分子構建融合蛋白，可以克服以上缺點［10-11］。 本文通過TNFα 與肝細胞靶向肽CSPⅠ-plus 相結合，獲得肝靶向肽-人腫瘤壞死因子融合蛋白CSP-TNFα，以期提高TNFα 靶向性、達到肝細胞聚集高濃度TNFα 的效果、降低用量和毒副作用，為后期檢測其生物學活性奠定基礎。

本研究以反轉錄PCR 克隆TNFα cDNA 為基礎，利用重疊延伸PCR（SOEing PCR）技術成功構建融合基因CSP-TNFα，該方法操作簡單，因無需設計內切酶位點而引入不必要的氨基酸殘基，使融合蛋白更接近天然多肽。 生物信息學分析得出，融合蛋白CSP-TNFα 含187 個氨基酸，相對分子質量約為21 000，能夠在大腸桿菌系統中穩定表達，且具有良好的疏水性便于分離制備；另外，CSP-TNFα 融合蛋白具有TNFα 和CSP 100%同源保守功能域和6×His純化結構域。 大腸桿菌表達系統因培養周期短、目標基因表達水平高、遺傳背景清楚，是目前應用最為廣泛的蛋白表達體系［16-17］，但表達的目的蛋白易形成無活性的包涵體。 據文獻報道，降低誘導溫度可降低包涵體形成［18］。 6×His 標簽相對分子質量小、低免疫原性、親水性，是被公認使用的融合蛋白標簽，用于一系列目的蛋白純化。 為保證6×His 標簽融合蛋白CSP-TNFα 表達產物的正確結構和生物活性，行使蛋白功能，本文將原核表達載體CSPTNFα／pET21b 轉入感受態大腸桿菌進行低溫誘導表達，盡量避免進行包涵體表達，提高可溶性表達。經實驗發現：在誘導溫度為37 ℃時，融合蛋白CSPTNFα 幾乎全部形成包涵體；在誘導溫度為20 ℃時，大部分融合蛋白CSP-TNFα 以可溶性形式表達，獲得較多可溶性融合蛋白CSP-TNFα，這可能與低溫狀態下蛋白表達速度緩慢并促進其正確折疊有關［18］，因此后續實驗選擇誘導條件為20 ℃，20 h 進行低溫可溶性表達并進行蛋白Ni 柱純化。

本實驗成功構建CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 原核表達系統并進行可溶性表達及鑒定和純化，成功制備一種可能對肝癌細胞具有靶向性的CSP-TNFα 融合蛋白，為下一步研究其生物學活性奠定了基礎。