Repsox 對人胚胎干細胞分化為肝細胞的影響

李秋鴻盧嘉怡

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州510006）

原位肝移植能夠顯著提高終末期肝病患者的生存率和生活質量，但是這項技術非常昂貴和復雜，并且受到肝臟供體的限制［1］。 人原代肝細胞被認為是藥理學與毒理學、細胞移植研究的合適模型［2］。動物實驗研究結果表明，肝細胞移植可以用于治療肝臟代謝性疾病以及肝功能衰竭［3］。 在某些特定的情況下，肝細胞移植還能夠促進宿主的肝細胞再生，從而使宿主避免了后續的器官移植治療。 然而人原代肝細胞的來源非常有限，在體外很難培養與擴增［4］。 人多能干細胞（包括人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞）能夠在體外合適的分化體系下被定向誘導為肝細胞，這為肝臟疾病潛在藥物的篩選、肝臟疾病模型的建立以及肝細胞移植治療提供了可再生的細胞來源［5］。 肝細胞分化的過程一般包括將人多能干細胞定向誘導為原條、定型內胚層、前腸以及肝祖細胞，最后分化為肝細胞［6］。 由于細胞存在異質性以及往往經歷比較長的誘導周期，人們總是很難將多能干細胞完全誘導分化為某種單一類型的細胞群體，因此體外肝細胞的誘導效率并不高［6］。因此，本研究旨在探索并建立一套能夠顯著提高肝分化效率的方法。 研究發現在肝細胞分化后期加入一種化學小分子藥物-Repsox，可以比較顯著地提高肝細胞的分化效率；經Repsox 處理后，細胞群體能夠分泌更多的白蛋白（albumin），并合成更多的尿素（urea）。

1 材料

1.1 細胞

人類胚胎干細胞株H1 來自于威斯康星州WiCell 研究所（Wicell，Madison，WI）。

1.2 主要試劑

mTeSR1（Stemcell Technologies）；Matrigel（BD Biosciences）；Accutase（Sigma）；RPMI／B27（Gibco）；Activin A （Peprotech）； BMP2 （Peprotech）； FGF4（Peprotech）；HGF（Peprotech）；KGF（Peprotech）；Oncostatin-M （ R＆D Systems）； hepatocyte culture media（HCM，Lonza）；Repsox（Selleck）；Trizol 試劑（MRC）；ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO）；SYBR Premix Ex Taq Kit（TAKARA）；TGFβ1 ELISA Kit（R＆D Systems）；Albumin ELISA Kit（KOMABIOTECH）；FBS （HyClone）；ALB 抗體（GeneTex）；Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Goat IgG Antibody （Invitrogen）；DAPI（Sigma）。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss，型號：Zeiss Axiovert A1）； CFX96 Touch 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號：CFX96 Touch）；Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss，型號：Carl Zeiss LSM710）； 全自動生化分析儀（邁瑞Mindray，型號：BS-450）。

2 方法

2.1 干細胞培養與肝細胞定向分化

人類胚胎干細胞培養：將未分化的人類胚胎干細胞H1 接種于鋪有Matrigel 的培養板上，加入mTeSR1 培養液在37 ℃、5%（φ）CO2的條件下進行單層培養。 當細胞密度較大時，采用Accutase 消化液按照1 ∶4～1 ∶6的比例進行傳代。

肝細胞定向分化［11］：當細胞密度接近95%左右時，加入含有100 ng／mL Activin A 重組蛋白的RPMI／B27 培養液誘導培養3 d（D3）；然后加入含有20 ng／mL BMP2 蛋白和30 ng／mL FGF4 蛋白的RPMI／B27 培養液誘導培養4 d（D7）；隨后加入20 ng／mL HGF 蛋白和20 ng／mL KGF 蛋白的RPMI／B27 培養液誘導培養6 d（D13）；最后在含有20 ng／mL Oncostatin-M 的肝細胞培養液（不含有EGF）誘導培養8 d（D21）。 實驗組在D13 開始添加1 μm Repsox 直至D21 結束。

2.2 RT-qPCR 檢測TGFβ1 的表達

在肝細胞定向誘導過程中，用Accutase 消化液處理D0、D3、D13、D21 的細胞，收集細胞懸液后離心，加入約1 mL Trizol 試劑，使細胞完全裂解。 加入氯仿，取水相至預冷的異丙醇中獲得RNA 沉淀，將其重新溶解于蒸餾水中測定濃度。 依據ReverTra Ace qPCR RT Kit 的說明書，將2 μg RNA 反轉為cDNA 并適度稀釋，用作下一步qPCR 反應的模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit 進行qPCR 反應，以GAPDH為內參。

所用引物的序列如下：TGFβ1，5′-CTAATGGTG GAAACCCACAACG-3′（正向），5′-TATCGCCAGGAA TTGTTGCTG-3′（反 向）；GAPDH，5′-AGGGCTGCT TTTAACTCTGGT-3′（正向），5′-CCCCACTTGATTTTG GAGGGA-3′ （反向）。

2.3 酶聯免疫吸附（ELISA）檢測TGFβ1 蛋白、albumin 蛋白的含量

嚴格按照TGFβ1 ELISA Kit、Albumin ELISA Kit說明書的操作步驟進行。

2.4 尿素含量測定

當細胞分化至21 d，在培養液中額外加入5 mmol／L NH4Cl，將細胞繼續在5%CO2，37 °C 培養24 h。 收集培養液上清，離心取上清。 依據紫外-谷氨酸脫氫酶法，利用全自動生化分析儀測定培養液上清中的尿素含量。

2.5 免疫熒光檢測albumin 蛋白的表達

采用4%（φ）多聚甲醛固定細胞30 min，加入0.3% Triton X-100 溶液通透30 min，然后加入10%FBS 溶液室溫孵育1 h。 加入羊抗人ALB 一抗于4 ℃冰箱中孵育12 h，PBS 清洗3 次，再加入Alexa Fluor? 488 標記的驢抗羊二抗避光孵育1 h，最后加入DAPI 避光孵育5 min，PBS 清洗3 次后封片。 使用Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡進行拍照。

2.6 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics（1.0.0.1275）統計軟件對結果進行統計學分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 肝細胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達量和蛋白分泌量變化

人胚胎干細胞株H1 定向誘導為肝細胞過程中，細胞的形態發生了顯著的變化，由典型的上皮樣細胞（D0）變化為間充質樣細胞（D3）再轉變為上皮樣的肝細胞（D21），見圖1。 肝細胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達量和蛋白分泌量都呈現先大幅增加后緩慢減少的趨勢，與D21 細胞相比，胚胎干細胞中TGFβ1 的mRNA 表達和蛋白分泌水平較低（P＜0.01）；而D3 和D13 細胞群體的TGFβ1的mRNA 表達和蛋白分泌水平較高（P＜0.05），見圖2。

3.2 Repsox 對肝細胞中TGFβ1 的mRNA 表達和蛋白分泌水平的影響

在體外肝細胞誘導分化的第4 階段，加入TGFβ信號通路的特異性抑制劑Repsox，通過檢測D21 細胞中TGFβ1 的mRNA 表達量以及上清培養液中TGFβ1 蛋白分泌量發現，加入Repsox 能夠顯著地抑制D21 細胞中TGFβ1 的mRNA 表達量（P＜0.05）和上清培養液中TGFβ1 蛋白的分泌量（P＜0.05），結果見圖3。

圖1 肝細胞分化過程中細胞的形態變化（標尺：20 μm，100×）Figure 1 Morphological changes of hepatocytes during differentiation of hESCs （Scale bar： 20 μm，100×）

圖2 肝細胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達量和蛋白分泌量變化Figure 2 Changes of TGFβ1 mRNA expression and protein secretion during hepatocyte differentiation

3.3 Repsox 對肝細胞體外誘導分化效率的影響

如圖4 所示，實驗組中表達ALB 蛋白的細胞數量多于對照組。 與此同時，實驗組中albumin 分泌量以及尿素合成量明顯高于對照組（P＜0.05），結果見圖5。

圖3 Repsox 抑制肝細胞中TGFβ1 的mRNA 表達量和蛋白分泌量Figure 3 Inhibition of Repsox on TGFβ1 mRNA expression and protein secretion in hESCs-derived hepatocytes

圖4 對照組與實驗組D21 細胞中ALB 蛋白的表達情況（標尺：20 μm）Figure 4 ALB expression in D21 cells treated with or without Repsox （Scale bar： 20 μm）

圖5 對照組與實驗組D21 細胞中白蛋白分泌量及尿素合成量測定Figure 5 Determination of albumin secretion and urea synthesis in D21 cells treated with or without Repsox

4 討論

人多能干細胞在體外具有自我更新和多譜系分化的潛能，它們在諸多方面都與胚胎外植體有相似之處，因此它們是人們研究胚胎發育的重要體外模型［7］。 人多能干細胞能夠在多重信號分子的連續作用下轉變為肝細胞，該過程的進行涉及多種信號通路的參與，相關分子機制尚不完全清楚［8］。 在人肝細胞體外分化過程中，細胞會在分化初期由原本的上皮細胞狀態轉變為間充質細胞狀態；到分化后期，細胞又會由間充質細胞狀態逐漸回到上皮細胞狀態，即發生了上皮-間充質轉化和間充質-上皮轉化兩個事件［9］。 前一個事件的發生比較明顯，容易觀察與檢測；而后一個事件的發生卻不太顯著，對誘導至第21 天的細胞進行RT-qPCR 檢測，還能夠發現某些特定間充質標志物的表達［9］。 這可能是體外誘導的肝細胞在成熟度和功能方面不及原代肝細胞的原因之一［10］。

上皮-間充質轉化及其逆過程的發生往往與TGFβ 通路密切相關［11-12］，本研究檢測了肝細胞誘導分化過程中TGFβ1 蛋白的表達情況，結果發現：TGFβ1 基因的表達和蛋白分泌量在誘導分化初期顯著上調，而在誘導分化末期則逐漸下調，但下調幅度遠不及上調幅度大，由此推測TGFβ1 基因的不完全下調可能是影響肝細胞分化效率的因素之一。 本研究試圖通過在肝細胞誘導分化后期添加小分子抑制劑Repsox 來抑制TGFβ1 基因的表達［13］，并評估其對肝細胞分化效率及肝細胞功能的影響。 實驗結果表明，在分化后期加入Repsox 以后，誘導至第21 天的細胞群體中表達白蛋白的細胞數量增加；檢測誘導至第21 天的細胞群體的白蛋白分泌量和尿素合成量，均發現相比于對照組有了顯著的增加。 以上結果說明，通過在誘導分化后期加入小分子抑制劑Repsox 有利于促進TGFβ1 基因的表達下調，最終引起肝細胞的分化效率以及肝細胞功能水平的增加。

本研究建立了提高體外肝分化效率及改善肝細胞功能的方法，為下一步建立病人個性化的體外疾病模型和藥篩模型提供了參考；功能上更接近于原代成熟肝細胞的誘導肝細胞的獲得，為肝細胞移植治療提供了可靠的再生資源。