復(fù)方熊膽滴眼液治療急性細(xì)菌性結(jié)膜炎作用及其機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

王珊珊黃楚龍黎芳劉巧明林憶龍方雪灣梁健欽

（1.中山大學(xué)中山眼科中心藥學(xué)部，廣東 廣州510060； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530200）

結(jié)膜炎是一種發(fā)生在結(jié)膜上的炎癥疾病，臨床上常見的有急性細(xì)菌性結(jié)膜炎和流行性角結(jié)膜炎，發(fā)病急是該病特點(diǎn)，伴以流淚畏光、結(jié)膜充血發(fā)紅，俗稱紅眼病［1-2］。 中醫(yī)認(rèn)為該病由肝肺內(nèi)熱，內(nèi)熱壅盛上犯于目，與復(fù)感外邪（以風(fēng)熱為主）所致［3］。 復(fù)方熊膽滴眼液是2015 年版《中國藥典》收載品種，由熊膽粉、天然冰片組成，方中熊膽粉平肝明目、退熱清火，冰片能通諸藥、散郁火、去翳明目［4］。 我院（中山大學(xué)中山眼科中心）收集多例急性細(xì)菌性結(jié)膜炎患者，通過研究表明復(fù)方熊膽滴眼液用于臨床治療急性細(xì)菌性結(jié)膜炎療效確切，但作用機(jī)制未明確。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，依靠網(wǎng)絡(luò)方法構(gòu)建“藥物-基因-靶點(diǎn)蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，能系統(tǒng)分析中藥復(fù)方對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的相互作用，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)［5］，是目前研究中藥復(fù)方作用機(jī)制的有效手段。 因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，嘗試從整體、系統(tǒng)的角度分析復(fù)方熊膽滴眼液治療急性細(xì)菌性結(jié)膜炎的作用機(jī)制，為研究該中成藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 軟件及數(shù)據(jù)庫

TCMSP （http：／ ／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp. php）、DRAR-CPI（http：／ ／cpi.bio-x.cn／drar／）、ChemSpider數(shù)據(jù) 庫（http：／ ／www. chemspider. com／）、PubChem Compound 數(shù) 據(jù) 庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫（version 5.1.1，https：／ ／www.drugbank.ca／）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）、String 數(shù)據(jù)庫（version 10.5，https：／ ／string-db.org／）、Cytoscape（version 3.7.1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 臨床療效觀察

2.1.1 一般資料隨機(jī)選取中山大學(xué)中山眼科中心2018 年2 月—2018 年12 月就診的急性細(xì)菌性結(jié)膜炎患者80 例，隨機(jī)均分為對(duì)照組及觀察組，對(duì)照組患者為21 例女性與19 例男性，年齡18 ～40 歲，平均（29.73±4.45）歲，觀察組患者為22 例女性與18例男性，年齡20 ～41 歲，平均（31.73±3.87）歲。兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組及觀察組均接受眼部炎癥反應(yīng)檢查排除其他眼部疾病，患者有畏光、流淚、目赤腫痛、黏膿性分泌物等，符合診斷要求［6］。

2.1.3 治療方法對(duì)照組給予左氧氟沙星滴眼液（河北創(chuàng)健藥業(yè)有限公司），滴入眼瞼內(nèi)，滴藥3 次／d，2 滴／次；觀察組給予復(fù)方熊膽滴眼液（長春普華制藥股份有限公司），滴入眼瞼內(nèi)，滴藥6 次／d，2 滴／次。 均連續(xù)用藥3 d。

2.1.4 觀察指標(biāo)觀察兩組患者治療后的臨床療效，療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］：治愈，患者用藥后臨床癥狀及體征消失；顯效，患者用藥后臨床癥狀及體征明顯改善；有效，患者用藥后臨床癥狀及體征好轉(zhuǎn)；無效，患者用藥后臨床癥狀及體征無變化；總有效率＝（治愈＋顯效＋有效）／總例數(shù)×100%。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.6 結(jié)果觀察組有效率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 化合物篩選及其作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）檢索冰片的化合物（化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)：OB ≥30%、DL ≥0.18 或符合Lipinski 類藥性五原則均納入），共得到α-蒎烯、齊墩果酸、異龍腦等31 種化合物。 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫、ChemSpider 數(shù)據(jù)庫檢索［8-14］，得到熊膽粉中含有的牛磺熊去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、熊去氧膽酸等11 個(gè)化合物。 然后，通過PubChem Compound 數(shù)據(jù)庫檢索，獲得上述42 個(gè)化合物的3D 結(jié)構(gòu)，并保存為SDF 格式文件，導(dǎo)入DRAR-CPI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并以對(duì)接分?jǐn)?shù)Z′-score＜-1.5（Z′-score＜-0.5 時(shí)化合物與靶點(diǎn)潛在結(jié)合的可能性，值越小的化合物和靶點(diǎn)的結(jié)合牢固）對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得192 個(gè)化合物靶點(diǎn)，最后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫以校正192 個(gè)化合物靶點(diǎn)的名稱為官方名稱。

2.2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選、發(fā)病機(jī)制分析通過TTD 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)膜炎的疾病靶點(diǎn)，關(guān)鍵 詞 有 “ conjunctivitis ”， “ epidemic keratoconjunctivitis”，“acute bacterial conjunctivitis”，并以來源于人（Homo sapiens）為條件篩選疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到85 個(gè)結(jié)膜炎的疾病靶點(diǎn)，同法校正靶點(diǎn)名稱。 將85 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無相互作用的靶點(diǎn)，進(jìn)行蛋白互作分析，然后保存TSV 文件格式，最后導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖（如圖1）。 Degree 值越大則表示該靶點(diǎn)是疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與疾病密切相關(guān)，提示人們可尋找或開發(fā)該靶點(diǎn)的抑制劑，以達(dá)到緩解甚至治愈疾病的新藥。 按Degree 值由大到小排序前35 個(gè)疾病靶點(diǎn)如下（括號(hào)內(nèi)為該蛋白的Degree 值，下同）：IL6（43），TLR4（32），NFKB1（32），TLR2（30），ICAM1（30）， STAT3 （26）， RELA （25）， IKBKB （24），HSP90AA1（23），CHUK （22），MTOR （21），SYK（18），LYN（18），PRKCA（17），TBK1（15），HMGB1（15）， NFKB2 （14）， NOD2 （14）， CXCR4 （14），PRKCZ（13），PRKCB（12），IL12B（12），PRKCD（12），PRKCE（12），IL23A（11），LY96（11），PRKCQ（11），CD14（11），MUC1（11），CRP （11），ITIH4（10），RIPK2（9），HSPA8（9），IL6R（8），KRT5（8）。GO 和KEGG 分析顯示，急性細(xì)菌性結(jié)膜炎的發(fā)病涉及免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)菌防御反應(yīng)及對(duì)外部刺激、細(xì)菌來源分子反應(yīng)等714 個(gè)生物過程，涉及病毒受體、信號(hào)傳感、蛋白激酶等的活性和蛋白質(zhì)結(jié)合、小分子結(jié)合等共38 個(gè)分子功能，并由囊泡、膜結(jié)合泡、胞外間隙、白細(xì)胞介素-6 受體復(fù)合物及免疫突觸等47 個(gè)細(xì)胞成分條目參與。 該病與甲型流感、病毒感染、PI3K-Akt 信號(hào)通路、單純皰疹病毒感染、炎癥介質(zhì)對(duì)色氨基酸通道調(diào)節(jié)作用及血管平滑肌收縮等104 條信號(hào)通路異常相關(guān)。

表1 兩組患者治療后的臨床療效Table 1 Clinical efficacy of the two groups after treatment ［n （%）］

圖1 疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)PPI 圖Figure 1 PPI map of disease target

2.2.3 化合物靶點(diǎn)及其作用機(jī)制分析將192 個(gè)化合物靶點(diǎn)與85 個(gè)疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，去除無相互作用的靶點(diǎn)，最后得到一個(gè)由215 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 945 條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)度為18.1，網(wǎng)絡(luò)密度為0.54。 選取combined score＞0.9 的邊（edge，即蛋白的作用關(guān)系），共篩選出由36 個(gè)化合物作用靶點(diǎn)［分別是SRC（34），MAPK3（33），MAPK1（32），TP53（32），EGFR（31），PIK3R1（30），IL4（30），JUN（30），VEGFA（30），IL1B（29），TNF（29），JAK2（26），MAPK14（29），PIK3CG（28），MAPK8（28），HGF（27），HRAS（25），APP（25），PLG（24），CCL2（24），RHOA（23），VCAM1（22），LCK（21），JAK3（18）， SELE （16）， CHRM1 （12）， HTR2A （10），ADRA1B（9），GHR（9），CHRM3（9），BTK（9），ADRA1A（9），ADRA1D（8），CSF2RB（7），B4GALT1（2），B4GALT4（2）］和15 個(gè)疾病靶點(diǎn)［（分別是STAT3（29），ICAM1（26），SYK（20），IL6R（14），LGALS3（12），PTAFR（12），HRH1（10），TIMP3（9），KRT8（8）， LUM （7）， ORM2 （6）， ORM1 （6），MAPKAPK2（6），KRT5（4），MKL1（1）］組成的關(guān)鍵靶點(diǎn)集。 將上述51 個(gè)靶點(diǎn)組成的靶點(diǎn)集導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得到一個(gè)由51 個(gè)節(jié)點(diǎn)、461 條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)度為18.1，網(wǎng)絡(luò)密度為0.801，網(wǎng)絡(luò)密度增加，說明該網(wǎng)絡(luò)較之前的大網(wǎng)絡(luò)（網(wǎng)絡(luò)密度為0.54）更重要。 對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，GO 分析結(jié)果顯示，該復(fù)方熊膽滴眼液調(diào)控了包括轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng)、對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞定位、防御反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路等789 個(gè)生物過程，以及影響蛋白質(zhì)結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、信號(hào)傳感器活動(dòng)、酶結(jié)合、α1-腎上腺素能受體活性、MAP 激酶活性、磷酸酶結(jié)合等55 個(gè)分子功能。 KEGG 分析顯示，51 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集的KEGG 通路如表2 所示，信號(hào)通路為按出錯(cuò)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）由小到大排列，前10 位的通路見表2，提示復(fù)方熊膽滴眼液治療結(jié)膜炎與調(diào)控Proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等多條信號(hào)通路有關(guān)。

2.2.4 “藥材-化合物-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將藥材與其對(duì)應(yīng)的化合物、化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)所篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。 可見，復(fù)方熊膽滴眼液通過多靶點(diǎn)作用及多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮治療結(jié)膜炎的作用，其中熊膽粉化合物的靶點(diǎn)發(fā)揮了主要作用。

表2 復(fù)方熊膽滴眼液KEGG 富集分析結(jié)果Table 2 KEGG enrichment analysis of FuFang Xiongdan Diyanye

圖2 藥材-化合物-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network diagram of drug-compound-target-signal pathway

3 討論

3.1 復(fù)方熊膽滴眼液可能作用于STAT 3、ICAM1、HRH1 等靶點(diǎn)

前房炎癥破壞了角膜內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，嚴(yán)重可導(dǎo)致視力喪失，是造成失明的主要原因之一。STAT 3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）信號(hào)的激活通過炎癥調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種反應(yīng)，介導(dǎo)屏障功能標(biāo)志ZO-1 的表達(dá)。 磷酸化STAT3 水平會(huì)隨著炎癥發(fā)生時(shí)LIF、IL-6 和IFN-γ 等細(xì)胞因子水平的升高而升高，從而降低ZO-1 蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 STAT 3 的轉(zhuǎn)錄激活直接調(diào)控ZO-1 啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)節(jié)屏障功能，可見，STAT 3 能保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)多種炎癥因子的損害和對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要性［15］。 STAT3 可增強(qiáng)NA組細(xì)胞增殖能力，對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激有保護(hù)作用［16］。 本文研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 靶點(diǎn)與結(jié)膜炎的病程密切相關(guān)，是該疾病的重要靶點(diǎn)，且“核心化合物靶點(diǎn)-核心疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果也顯示復(fù)方熊膽滴眼液的化合物多個(gè)靶點(diǎn)（JAK2、SRC、EGFR、JAK3、LCK、CSF2RB、VEGFA、JUN、MAPK8）均直接作用于STAT3，提示復(fù)方熊膽滴眼液通過化合物靶點(diǎn)直接作用于STAT3 發(fā)揮治療作用。

黏附分子1（ICAM1）是在細(xì)胞表面表達(dá)的一類能夠介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的糖蛋白，分布在活化的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的表面，可與多種細(xì)胞的表面成分結(jié)合，形成網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞調(diào)控功能，在炎癥、免疫反應(yīng)及創(chuàng)傷修復(fù)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。 ICAM1 與白細(xì)胞表面的淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 結(jié)合，并介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏連及穿過血管內(nèi)皮移行到炎癥組織和創(chuàng)傷部位，促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展，從而導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織的損傷［17］。 由本文的結(jié)果可推測(cè)，SELE、TNF、VCAM1等多個(gè)化合物靶點(diǎn)直接作用ICAM1 以減輕結(jié)膜炎的炎癥反應(yīng)。

組胺受體H1（HRH1）是發(fā)現(xiàn)最早的一類炎癥介質(zhì)，主要分布在肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞中，介導(dǎo)平滑肌收縮、炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)血管的收縮與通透性；末梢靜脈收縮導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加；參與過敏反應(yīng)、胃酸分泌、血管調(diào)節(jié)等過程。 肥大細(xì)胞被活化后釋放組胺進(jìn)而促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8 等炎癥因子，間接影響炎癥的發(fā)展［18］。 HRH1 可舒張血管，降低毛細(xì)血管的通透性，導(dǎo)致人體出現(xiàn)充血、水腫的癥狀；使人淚腺分泌增加出現(xiàn)流淚現(xiàn)象；還可刺激神經(jīng)末梢誘發(fā)瘙癢感，目前被公認(rèn)為引起瘙癢的介質(zhì)［19］。 從上述組胺的功能作用發(fā)現(xiàn)，HRH1 引發(fā)的現(xiàn)象與結(jié)膜炎出現(xiàn)的癥狀均吻合，提示它與結(jié)膜炎的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。 通過本文結(jié)果分析，認(rèn)為復(fù)方熊膽滴眼液可能是CHRM1、APP、PIK3R1、ADRA1D 等8 個(gè)化合物靶點(diǎn)作用于HRH1，從而緩解結(jié)膜炎引起充血、流淚、瘙癢等癥狀。

3.2 復(fù)方熊膽滴眼液可能參與調(diào)控PI3K-Akt、Influenza A 等多條信號(hào)通路

病毒感染后，在細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白合成和病毒附著而激活PI3K／Akt 信號(hào)通路，然后通過干擾促凋亡信號(hào)反應(yīng)，維持細(xì)胞活力和增殖，進(jìn)而激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)病毒復(fù)制，表明PI3K 支持病毒的進(jìn)入和萌發(fā)等生命周期［20-21］。 SYK、JAK2 等化合物靶點(diǎn)介導(dǎo)Influenza A、PI3K／Akt 信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖和存活、血管生成、細(xì)胞因子調(diào)控、病毒蛋白表達(dá)、巨噬細(xì)胞趨化作用等生物功能，調(diào)控著IL-6、ICAM1等疾病因子的表達(dá)。 本文通過構(gòu)建關(guān)鍵的化合物-疾病的靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，并借助數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，GO 功能富集分析結(jié)果提示關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與了多種細(xì)胞調(diào)控、白細(xì)胞遷移、增殖、凋亡等生物學(xué)過程和分子功能，KEGG 富集分析結(jié)果顯示這些關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集到與炎癥、皰疹病毒感染、流感以及腫瘤等與結(jié)膜炎相關(guān)通路上。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)復(fù)方熊膽滴眼液及急性細(xì)菌性結(jié)膜炎的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作分析，初步闡明了復(fù)方熊膽滴眼液治療急性細(xì)菌性結(jié)膜炎的作用機(jī)制，進(jìn)一步可以虛擬篩選有效成分及核心疾病靶點(diǎn)，從分子水平探討復(fù)方熊膽滴眼液治療結(jié)膜炎的作用機(jī)制。