細辛腦注射液被動皮膚過敏試驗及對血清IgE的影響

陳懷廣楊燦邦陳曉蕊杜為揚溫欽耀楊智承金桂芳

（廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州510006）

細辛腦注射液（又稱細辛醚注射液、α-細辛腦注射液）是一種中藥單體抗炎性祛痰止咳藥。 近年來的臨床研究［1-4］表明細辛腦注射液治療毛細支氣管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等呼吸系統疾病表現出較好的療效。 隨著該藥物在臨床的廣泛應用，不良反應報道逐年增加，引發了人們對細辛腦注射液安全性再評價的重視。 黨安建［5-7］等對不良反應監測中心收集的細辛腦不良反應報告進行統計分析，提示細辛腦注射液誘發的不良反應多為急性過敏樣反應，且以速發型過敏反應為主，這類過敏反應是由免疫球蛋白E（IgE）介導的抗原抗體反應。 目前主要以臨床癥狀為主要判斷依據，并無實驗室證據支持。

本研究按照國家食品藥品監督管理局發布的《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應）研究的技術指導原則》［8］對細辛腦注射液進行豚鼠被動皮膚過敏試驗（passive cutaneous anaphylaxis，PCA），考察細辛腦注射液的致敏性，為臨床合理用藥提供參考，并檢測致敏豚鼠血清中IgE 的含量初步探索過敏反應類型。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性豚鼠，SPF 級，體質量250 ～350 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（粵）2017-0041。 動物分籠喂養，溫度17 ～25 ℃，相對濕度30%～70%。

1.2 主要試劑

細辛腦注射液（海南利能康泰制藥有限公司，5 mL／支，批號為1701135）；葡萄糖生理鹽水（安徽雙鶴藥業有限責任公司，批號為160408）；伊文思藍（廣州市齊云生物技術有限公司， 批號為gy201106）；豚鼠IgE- Elisa 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為20170315）。

1.3 主要儀器與設備

渦旋 振 蕩 儀（美 國Essenscien 公 司， V3）；Multiskan Go 型全波長掃描儀（美國Thermo 公司）；微量移液器［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；IMS-70 型全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。

2 方法［8?11］

2.1 致敏及制備抗血清

取雄性豚鼠24 只，隨機分為4 組：陰性對照組、細辛腦注射液低劑量組（3.72 mg／kg）、細辛腦高劑量組（7.44 mg／kg）、陽性對照組，每組6 只。 細辛腦注射液低劑量為人臨床用量的等倍劑量，高劑量為人臨床用量的2 倍劑量。 陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予同體積5%新鮮蛋清液，致敏途徑為腹腔注射，隔日1 次，共4 次，末次致敏14 d 后取血，3 000 r／min 離心15 min，分離上層血清，保存備用。

2.2 IgE 含量的測定

采用豚鼠ELISA 試劑盒（競爭法）對“2.1”項中制備的抗血清進行IgE 含量測定。

2.3 被動皮膚過敏反應

將各組豚鼠背部脫毛，脫毛面積約為3 cm×4 cm，將“2.1”項中制備的抗血清用生理鹽水分別稀釋為1 ∶2和1 ∶8，分別皮內注射于脫毛區域距脊柱1.5 cm的兩處，注射體積為0.1 mL，進行被動致敏。24 h 后，各組豚鼠靜脈注射含1%伊文思藍的相應藥液1 mL 進行激發。 激發30 min 后脫頸處死各組豚鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內層的藍斑直徑，不規則斑點直徑為長徑與短徑之和的平均值，直徑＞5 mm者判定為被動過敏反應陽性，比較各組過敏反應陽性率來確定藥物致敏性。

2.4 統計學處理

使用SPSS19.0 進行統計學分析，各組抗血清中的IgE 含量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；陽性率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 水平的影響

結果見表1，細辛腦注射液高劑量組和陽性對照組豚鼠血清中IgE 含量均明顯升高，與陰性對照組相比差異有統計學意義（P＜0．05 或P＜0.01），細辛腦低劑量組豚鼠血清中IgE 水平與陰性對照組相比增加不明顯。

表1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 含量影響Table 1 Effects of asarone injection on serum IgE concentrations of guinea pigs（n＝6，±s）

表1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 含量影響Table 1 Effects of asarone injection on serum IgE concentrations of guinea pigs（n＝6，±s）

與陰性對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 劑量／（mg·kg-1）IgE／（mg·L-1）陰性對照組 - 5.15±1.2細辛腦注射液 低劑量組 3.72 5.88±1.6 高劑量組 7.44 7.05±2.0?陽性對照組 5%雞蛋清 9.12±1.9??

3.2 細辛腦注射液對豚鼠被動皮膚過敏反應的影響

由表2 可見，抗血清稀釋比例為1 ∶2和1 ∶8 時，陰性對照組豚鼠背部皮膚均無藍斑出現。 陽性對照組豚鼠的背部脊柱左右兩側均出現明顯藍斑，且藍斑直徑均＞5 mm，陽性反應率為100%；細辛腦注射液低、高劑量組與陰性對照組相比，過敏反應陽性率均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。 且皮內注射稀釋比例1 ∶2 抗血清和1 ∶8 抗血清的兩側出現的藍斑大小不同，注射稀釋比例1 ∶2 抗血清的一側的過敏反應陽性率高于注射1 ∶8 稀釋抗血清的一側，各組豚鼠背部皮膚藍斑見圖1。

表2 細辛腦注射液對豚鼠被動皮膚過敏反應陽性率的影響Table 2 Effect of asarone injection on the positive rate of passive cutaneous anaphylaxis in guinea pigs （n＝6）

圖1 細辛腦注射液對豚鼠被動過敏試驗皮膚藍斑形成的影響（1×）Figure 1 Effects of asarone injection on the formation of blue spots in the skin of guinea pigs in passive anaphylaxis test （1×）

4 討論

近年來中藥注射劑不良反應頻發，國家食品藥品監督管理局鼓勵對已上市的中藥注射劑特別是出現不良反應的進行安全性再評價［12］。 目前國內對細辛腦注射液不良反應的研究主要為不良反應報告的回顧性分析，而臨床前安全性評價的實驗性研究數據缺乏。

被動皮膚過敏試驗是一種比較敏感的測試特異抗體滴度和考察藥物是否誘發Ⅰ型過敏反應的方法。 致敏動物的血清內富含IgE 抗體，將其皮內注射于正常豚鼠后，IgE Fc 端與皮膚肥大細胞表面特異受體結合形成IgE 復合物，使正常動物被動致敏。使用致敏試劑靜脈注射時，抗原抗體結合導致肥大細胞脫顆粒釋放組胺等過敏介質，進而使皮膚局部血管通透性增加，伊文思藍染料可在抗血清皮內接種處滲出著色，測量該處皮膚藍染的范圍可知血管通透性變化的大小，能反映該致敏試劑誘發皮膚過敏反應的程度。 本試驗結果顯示細辛腦注射液低劑量組被動過敏反應陽性率為66.7%和33.3%（1 ∶2和1 ∶8 抗血清），細辛腦注射液高劑量組被動過敏反應陽性率為100%和83.3%（1 ∶2和1 ∶8 抗血清），說明細辛腦注射液可引起豚鼠非常明顯的被動皮膚過敏反應，反應強弱與劑量相關，且血清中IgE 含量高低影響過敏反應的強弱，結果符合文獻［5］中超劑量使用該藥是導致過敏反應的可能原因之一的報道，提示臨床使用相關制劑應嚴格規范使用劑量。

細辛腦注射液不良反應報告的分析提示其誘發的很可能是Ⅰ型過敏反應，IgE 是介導Ⅰ型超敏反應［11，13］的重要介質，血清或體液中IgE 水平的檢測對明確藥物誘發的是否為Ⅰ型變態反應和認識藥物誘發變態反應機制具有重要意義。 血清IgE 檢測結果顯示，細辛腦注射液高劑量組血清IgE 的含量與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），而細辛腦注射液低劑量組IgE 含量升高并不明顯，與其在被動皮膚過敏試驗中陽性反應結果不一致，這是由于試劑盒敏感性的限制還是由于細辛腦注射液會誘發多種類型的過敏反應，而不局限于Ⅰ型過敏反應，有待進一步分析研究。

細辛腦注射液成分復雜，其生產過程中加入的助溶劑如吐溫-80、丙二醇［14］以及注射劑的生產及存放過程中降解產生的β-細辛腦［15-16］都可能是致敏的原因，找出確切的引發過敏的成分并提高制劑工藝避免臨床應用不良反應的發生，需要科研人員和生產廠家的共同努力。