人參莖葉總皂苷治療2 型糖尿病的網絡藥理學研究

洪佳娜李冰冰陳楨琳趙麟肖雪關永霞張貴民

（1.廣東藥科大學廣東省代謝病中西醫結合研究中心，廣東 廣州510006；2.廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室，廣東 廣州510006；3.魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂276000）

2 型糖尿?。═2DM）是由遺傳、精神、免疫、環境等多因素相互作用導致的以血糖持續升高為主要特征的代謝紊亂疾病，主要有多飲、多食、多尿及體重下降等臨床表現，持續的血糖升高還將導致多組織、多器官的慢性并發癥［1］。 據2018 年國際糖尿病聯合會發表的數據顯示，全球糖尿病患者預計在2045年上升至6.93 億［2］。 2015 年，我國糖尿病患者總數達1.096 億，為糖尿病發生第一大國［3］。 現常用的糖尿病治療藥物包括胰島素及胰島素類似物、磺酰脲類與非磺酰脲類等胰島素促泌劑、噻唑烷二酮類等胰島素增敏劑、α-糖苷酶抑制劑、雙胍類、GLP-1受體激動劑等［4］。 這些藥物能夠有效控制血糖及減少并發癥的發生，但長期服用會產生不良反應，如二甲雙胍常見的不良反應為惡心、腹瀉、腹脹等消化道癥狀，降低了患者的生活質量［5］。

人參莖葉為五加科植物人參Panax ginsengC.A. Mey.的干燥莖葉，主要成分為皂苷類成分［6］。 而人參傳統入藥部位為人參的干燥根及根莖，《神農本草經》列為上品，其具有“補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣”的功效，其藥效基礎多為人參皂苷類成分。 研究發現人參莖葉所含的人參皂苷成分與人參根莖所含的人參皂苷成分相近，且含量明顯高于人參根［7］。 人參莖葉總皂苷也是多個治療T2DM 中成藥如參芪降糖顆粒等的重要處方藥味。人參莖葉總皂苷成分具有改善糖脂代謝、抗炎、抗疲勞、增強免疫力、護心、改善記憶等功效［8-10］，但其藥效物質基礎和作用機制等尚未完全明確。

網絡藥理學技術是通過構建藥物、成分、靶點、疾病、通路之間的復雜網絡預測藥物的作用機制，適用于中藥復雜體系機制研究［11］。 本文擬就人參莖葉總皂苷治療T2DM 開展網絡藥理學研究，預測人參莖葉所含的皂苷類成分治療T2DM 的藥效基礎、潛在靶點以及作用通路，以期為人參莖葉總皂苷防治T2DM 的作用機制提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 軟件與數據庫

使用軟件為Cytoscape3. 7. 1； 數據庫包括：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）［12］（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，V2.3）；Pubchem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）；SwissTargetPrediction［13］（http：／ ／www. swisstargetprediction. ch／index. php）；Uniprot（https：／ ／www. uniprot. org）；StringV11. 0［14］（https：／ ／string-db.org／）；Genecards （https：／ ／www.genecards. org／）； Scifinder （https：／ ／www. cas. org／products／scifinder）； DAVID 6. 8［15］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）。

1.2 人參莖葉總皂苷成分庫的構建

基于中國知網（http：／ ／www.cnki.net／）文獻檢索，結合TCMSP 數據庫，篩選出人參莖葉的皂苷類成分作為潛在藥效成分。 采用Pubchem 數據庫以及Scifinder 數據庫檢索潛在藥效成分的Canonical SMILES 結構式及CAS 號，并整理相關信息。

1.3 藥效成分靶點預測

Swisstargetprediction 數據庫是基于2D 和3D 結構相似性預測化合物作用靶點的網站，將各潛在藥效成分的 SMILES 結構式輸入搜索框， 設置“species”為“Homo sapiens”，進行分子靶點對接，得到的靶點即為藥效成分靶點，用MS Excel 整理為“藥效成分-靶點”關系對，保存為.xlsx 格式。

1.4 疾病靶點預測

利用Genecards 數據庫，以2 型糖尿病英文名稱“type 2 diabetes”、“T2DM”及“diabetes mellitus type 2”為檢索詞，收集得到與T2DM 相關的疾病基因，即為疾病靶點基因。

1.5 網絡構建

利用Uniprot 數據庫規范統一上述靶點命名，提取潛在藥效成分靶點與疾病相關靶點的交集，即為潛在治療靶點，將其導入String 數據庫，設置“species”為“homo sapiens”，得到潛在治療靶點間相互作用關系，導出為.tsv 格式，保留表格中的node1、node2 及combined score 等信息。 將“潛在藥效成分-靶點”關系對與潛在治療靶點間相互作用關系利用Cytoscape 3.7.1 構建藥效成分治療T2DM 作用靶點網絡及潛在治療靶點間相互作用網絡，同時利用“Network Analyzer”工具，對網絡的拓撲參數進行分析，用節點大小反映degree 值大小，用邊的粗細反映combined score，將重要靶點及結合分數可視化。

1.6 生物過程與通路分析

利用基因功能注釋在線分析工具DAVID 對篩選得到的人參莖葉總皂苷治療T2DM 的關鍵治療靶點基因進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析及GO（gene ontology）功能富集分析，設置P＜0.01。

2 結果

2.1 人參莖葉總皂苷成分篩選

本研究共搜集得到45 種皂苷類成分（表1），這些成分主要為達瑪烷型原人參二醇型皂苷、達瑪烷型原人參二醇型皂苷、齊敦果酸類皂苷等成分。

表1 人參莖葉總皂苷成分表Table 1 Ginsenosides of Ginseng stems and leaves

表1 （續）

2.2 人參莖葉總皂苷成分-疾病靶點預測

通過SwissTargetPrediction 虛擬篩選得到成分靶點，刪除重復及假陽性靶點，共得到成分靶點574個。 剔除無法查詢得到靶點的成分7 個，則共有待分析成分38 個。 由Genecards 數據庫共搜索得到與T2DM 相關靶點10 321 個，以“relevance score”排序，選取排名前1 000 的基因作為待分析靶點進行分析，將人參莖葉總皂苷成分靶點與待分析疾病靶點取交集得到活性成分靶點175 個。

2.3 人參莖葉總皂苷成分-作用靶點網絡構建

將38 個活性成分與175 個作用靶點導進Cytoscape 3.7.1 軟件中，構建“人參莖葉總皂苷成分-作用靶點”網絡，如圖1 所示。 圖1 顯示共有213 個節點，4 323 條邊，方形靶點代表人參莖葉總皂苷成分，圓形靶點代表人參莖葉總皂苷對應的治療T2DM 的作用靶點，邊代表節點間的相互作用。 其中，人參皂苷Rh3、人參皂苷F5、20（R）-原人參三醇為具有較多作用靶點的成分，在治療T2DM 的作用中可能發揮重要作用。 同時，靶點VEGFA（血管內皮生長因子A）、AKT1（絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶）、STAT3（信號傳導及轉錄激活因子）、EGFR（表皮生長因子受體）等靶點不僅與成分節點密切關聯，而且與靶點節點相互作用。 由此可見，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的作用是通過多成分、多靶點的復雜網絡實現。

2.4 蛋白互作網絡的構建與分析

圖2 所示為潛在治療靶點間相互作用網絡，共有175 個節點和2 874 條邊。 對網絡進行拓撲性質分析，平均degree 值為32.846，平均Betweenness Centrality 為0.005 38，平均ClosenessCentrality 為0.527，以平均degree ＞32.846，平均Betweenness Centrality＞0.005 38，平均ClosenessCentrality＞0.527為篩選條件，篩選關鍵節點，最終獲得關鍵節點34個，具體信息見表2。

圖1 成分-靶點網絡Figure 1 Components-targets network

圖2 靶點相互作用網絡Figure 2 Interaction network of targets

2.5 生物功能通路分析

將篩選得到的34 個關鍵靶點導進DAVID 在線分析平臺進行GO 富集分析及KEGG 通路分析，用氣泡圖表示涉及靶點數目排名前15 的生物過程及通路，見圖3～圖6。 GO 富集分析包括生物過程分析（biological process，BP）、分子功能分析（molecular function，MF）以及細胞組分分析（cellular component，CC）。 由圖3 生物過程分析可見，關鍵靶點主要涉及的生物過程包括PI3K 信號通路的調節（regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、蛋白質磷酸化的正調控（positive regulation of protein phosphorylation）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expression）、信號傳導（signal transduction）等生物過程。 由圖4細胞組分分析可見，關鍵靶點主要作用于細胞核（nucleus）、 細 胞 膜（plasma membrane）、 細 胞 質（cytoplasm）、細胞質基質（cytosol）等。 由圖5 分子功能分析可見，關鍵靶點主要涉及蛋白質結合（protein binding）、酶結合（enzyme binding）、ATP 結合（ATP binding）、激酶活性（kinase activity）等分子功能。 圖6 KEGG 通路分析結果可見，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的作用關鍵靶點主要涉及癌癥通路（21 個靶點／61.8%）、黏附斑（14 個靶點／41.2%）、磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路（14 個靶點／41.2%）、ErbB 信號通路（13 個靶點／38.2%）、TNF 信號通路（13 個靶點／38.2%）等，體現了人參莖葉總皂苷多成分、多靶點、多通路的作用機制。

圖3 關鍵靶點的生物過程富集分析Figure 3 Enriched gene ontology terms for biological process of key targets

圖4 關鍵靶點的細胞組分富集分析Figure 4 Enriched gene ontology terms for cellular component of key targets

圖5 關鍵靶點的分子功能富集分析Figure 5 Enriched gene ontology terms for molecular function of key targets

圖6 關鍵靶點的KEGG 通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis of key targets

3 討論

3.1 人參莖葉總皂苷關鍵成分與靶點探討

人參莖葉中的多種皂苷類成分調節血糖的作用已有研究證實，其機制主要與抗胰島細胞凋亡，改善胰島素抵抗與脂代謝相關。 人參皂苷Rb1 可增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，同時可通過上調葡萄糖轉運體的表達，促進葡萄糖的消耗，調節糖代謝紊亂［16］。 人參皂苷Rg1 可通過降低炎癥因子的表達，抑制炎癥反應以延緩糖尿病腎病的進展［17］。 人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd 均具有抗T2DM 及其并發癥進展的作用［18］。 本研究還發現人參皂苷Rh3、人參皂苷F5、人參皂苷Rg4、20（R）-原人參三醇等作用于多個T2DM 靶點，提示這些成分具有防治T2DM，改善糖代謝紊亂的潛在價值。

通過對靶點相互作用網絡的分析，發現AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF 等34 個關鍵作用靶點。AKT1 是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，能夠促進胰島功能，增強其增殖及抗損傷的能力［19］。 MAPK 參與了細胞增殖、凋亡、氧化應激等多種生理功能。TNF-α 可調節脂質代謝與葡萄糖轉運，與胰島素抵抗密切相關［20］。 人參莖葉總皂苷可能通過以上各靶點間相互作用共同發揮對T2DM 的治療作用。

3.2 人參莖葉總皂苷信號通路探討

DAVID KEGG 通路分析結果顯示，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的通路主要涉及與炎癥免疫相關的通路3 條，分別為PI3K-Akt 信號通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路；與細胞凋亡相關的通路1條，為ErbB 信號通路；與氧化應激相關的通路1 條，為FoxO 信號通路。 與癌癥相關的通路3 條，分別為proteoglycans in cancer、pathway in cancer、prostate cancer；與生物過程相關的通路2 條，分別為黏附斑（Focal adhesion）信號通路、Osteoclast differentiation信號通路；與激素調節相關的通路2 條，為Estrogen信號通路與Prolactin 信號通路；與疾病相關的通路3 條，分別為Hepatitis B、Hepatitis C、Chagas disease（American trypanosomiasis）。

3.2.1 PI3K-Akt 信號通路PI3K-Akt 信號通路被認為在胰島素和胰島素樣生長因子的代謝及有絲分裂活動中發揮關鍵作用。 Akt 是PI3K 的主要下游分子，PI3k 的亞基PI3K-p85 對胰島素敏感性產生負反饋調節，而PI3K-p110 通過影響下游分子的活性，調節信號的連續傳導［21］。 下游分子AKT 的激活可促進葡萄糖的轉運，通過調節葡萄糖6-磷酸及糖原合成酶激酶3 進一步調節糖酵解過程以及促進糖原產生［22］，與胰島素抵抗相關的T2DM 關系密切。 有研究通過體外細胞實驗證實小檗堿可以改善HepG2 細胞胰島素抵抗模型的胰島素抵抗，其機制與激活胰島素信號傳導中的PI3K／AKT 信號通路相關［23］。 除此之外，PI3K／AKT 信號通路還參與了細胞的增殖、生長及分化，與胰島B 細胞的凋亡關系密切。

3.2.2 Focal adhesion 信號通路Focal adhesion 具有機械結構功能與信號傳遞功能。 Focal adhesion信號通路一向被認為在細胞遷移中起關鍵作用［24］。Luk 等［25］發現脂肪細胞中Focal adhesion 信號通路的關鍵酶-黏附斑激酶（FAK）會隨著胰島素抵抗及肥胖而增加，這表明脂肪細胞FAK 對代謝有重要作用。 同時，研究證實脂肪組織FAK 對于維持胰島素敏感及葡萄糖的穩態是必須的。 蔣曦媛等［26］發現薏苡仁下調腎組織中FAK 及β1 整合素的表達，以減輕腎小球纖維化，延緩糖尿病腎病的進展。 由此可見，Focal adhesion 通路對于T2DM 及其并發癥均有重要作用。 本研究中發現的關鍵基因不包括FAK，人參莖葉總皂苷可能并非直接作用于FAK 基因，而是作用于FAK 上游因子EGFR，從而激活FAK 以對T2DM 起治療作用。

3.2.3 ErbB 信號通路ErbB 信號通路具有保護心肌，抑制心肌纖維化與促進血管新生的作用，主要與心肌細胞功能的正常發揮相關［27］。 有研究發現黃芪多糖正是通過介導NRG-1／ErbB 信號通路減少心肌細胞的凋亡，進而改善心功能［28］。 除此之外，鈣離子信號通路是ErbB 的重要下游信號通路，人參莖葉總皂苷可能通過作用于ErbB 信號通路中的靶點EGFR，關閉肌漿網膜上鈣離子通道防止出現心肌細胞內鈣離子過載，預防糖尿病性心臟病。 然而，又有研究表明通過阻斷EGFR 可以抑制腎臟免疫細胞的浸潤和氧化應激，增加胰島自噬活性等改善糖尿病腎病［29］。 所以，ErbB 信號通路的激活對于T2DM的發生發展可能是一把雙刃劍，有待于進一步評估與研究。

3.2.4 癌癥相關通路與T2DM 密切相關值得關注的是，本研究發現人參莖葉總皂苷治療T2DM 的通路包括許多癌癥通路，如proteoglycans in cancer、pathway in cancer、prostate cancer 等。 有大型的流行病學調查［30］發現，T2DM 患者某些特定部位的癌癥發病率相較于非（2 型）糖尿病患者明顯升高，如胰腺癌的發病率增加2 ～3 倍，肝膽癌的風險提高兩倍，乳腺癌的風險增加20%等；除此之外，T2DM 患者的癌癥死亡率也較高。 其機制與糖尿病患者的高胰島素血癥對腫瘤細胞微環境和細胞內信號傳導的影響，有助于腫瘤的生長有關。 胰島素和胰島素樣生長因子與胰島素受體結合進一步激活mTORPI3K-AKT、Ras-Raf-MAPK 信號通路與Jak-Stat 通路導致腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲增加［31］。 臨床一線口服降糖藥二甲雙胍即被發現通過MAPK 途徑誘導細胞凋亡并增強生長抑制和DNA 損傷誘導基因153 的表達而具有抗癌潛力。 由此可見，人參莖葉總皂苷不僅對T2DM 具有治療作用，同時也具有抗癌潛力。

3.3 小結

綜上所述，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的潛在有效成分可能是人參皂苷Rh3、人參皂苷Rb1、人參皂苷F5、20 （R） -原人參三醇等，這些成分可能通過對炎癥免疫、細胞凋亡、氧化應激、癌癥、激素調節等相關的信號通路，綜合作用于AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF 等關鍵靶點，共同調節糖代謝紊亂，改善糖尿病以及糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病血管病變等并發癥。