鮮鐵皮石斛顆粒的質量標準研究

郭彩娥阮沛樺胡欣鄧紅楊小催周國彥甘國興黃治

（1.清遠市中醫院藥學部，廣東 清遠511500； 2.廣東藥科大學廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州510006； 3.廣東藥科大學廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東廣州510006）

鮮藥是指未經任何可能導致藥材成分改變或損失的手段加工處理的“原生藥材”，在藥材采收及粗加工后即可使用的中藥原料。 鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是一種名貴的中草藥，又名鐵皮斗、黑節草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物的全草，其獨特的生長環境和保健功效，使之有“救命仙草”的美譽［1］。 中醫在用鐵皮石斛時，常要求以鐵皮石斛鮮品入藥，鮮藥的藥理研究表明，其與干品的藥理作用具有差異，鮮石斛性寒，其寒涼之性強于干品，所以石斛鮮品對熱證的治療效果優于石斛干品［2-4］。

清遠市中醫院、清遠市鮮藥制劑工程技術研究開發中心聯合廣東藥科大學根據臨床用藥需要，選取鮮鐵皮石斛為研究對象，以鮮藥材投料，研制成顆粒劑，使之完全保留鮮藥的特色，并解決鮮藥的保鮮問題。 多糖為鐵皮石斛的主要生物活性成分［5-6］，2015 年版《中國藥典》規定鐵皮石斛的總多糖按干燥品計算，不得少于25.0%。 多糖有淀粉性多糖和非淀粉性多糖之分，糊精、淀粉屬淀粉性多糖，非淀粉性多糖是指淀粉以外的多糖。 申瑞玲等［7］采用酶-熱水浸提法對藜麥麩水溶性非淀粉性多糖進行提取，效果良好，其中使用的酶為耐熱-α-淀粉酶和糖化酶，本研究參考該方法，采用糖化酶酶解法消除輔料對鐵皮石斛多糖測定的影響。 除多糖外，有研究表明，黃酮類成分也為鐵皮石斛另一活性成分，有較強的抗氧化活性［8-9］，但黃酮類成分的鑒別等指標并未納入2015 年版《中國藥典》。 因此，本研究建立了鮮鐵皮石斛顆粒的薄層鑒別方法，同時采用UPLC-PDA 法建立鮮顆粒特征圖譜，制定較為完善的鮮鐵皮石斛顆粒的質量標準，擬為其質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AcQuity UPLC（配置PDA，美國Waters 公司）；BSA224S-CW 型電子分析天平（賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.1 mg）；CP2250 型電子分析天平（賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.01 mg）；ZF-90 性暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）；UV-1800 紫外-可見分光光度儀（日本島津公司）；HK3300H 超聲波清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司）；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；TGL-20B 飛鴿牌離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW-80A 旋渦混合器（上海精科實業有限公司）。

1.2 試藥

鮮鐵皮石斛顆粒（自制，批號分別為S1：180618；S2：180626-1；S3：180626-2；S4：180626-3；S5：180626-4；S6：180628；S7：180912；S8：190314-1；S9：190314-2；S10：190314-3；除批號S2、S3、S7 所用石斛藥材產地為廣東外，其余批號的產地均為云南）；芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷對照品（質量分數：99.9%，批號：F0940192）、異夏佛塔苷對照品（質量分數：98.7%，批號：F0930336）、夏佛塔苷對照品（質量分數：99.31%，批號：F0850146）均購自中山市成諾生物科技有限公司；葡萄糖（批號：110833-201506，中國食品藥品檢定研究院）；糖化酶（批號：17122410，10 萬U／mL，上海士峰生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、四氫呋喃、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別［10］

2.1.1 供試品溶液的制備取鮮鐵皮石斛顆粒3 g，用二氯甲烷-甲醇（體積比9 ∶1）振搖提取2 次，每次40 mL，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備取石斛對照藥材0.2 g，加二氯甲烷-甲醇（體積比9 ∶1）15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備按處方比例制備石斛陰性樣品，照“2.1.1”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.4 薄層色譜條件薄層板：20 cm×10 cm 硅膠G 薄層板；點樣量：供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各5 μL；展開劑：甲苯-甲酸乙酯-甲酸（體積比9 ∶5 ∶1）；顯色及檢視：噴以10%硫酸乙醇試液，在95 ℃烘約3 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖1。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件AcQuity UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；體積流量：0.3 mL／min；檢測波長：337 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：四氫呋喃-乙腈-甲醇（10 ∶22 ∶5）為流動相A，質量分數0.05%磷酸為流動相B，梯度洗脫（0 ～9 min，9%→10%A；9 ～10 min，10%→11%A；10 ～12 min，11%→11.5%A；12 ～13 min，11.5%→14.5%A；13～20 min，14.5%→15%A；20 ～25 min，15%A；25～30 min，15%→38%A；30～32 min，38%→9%A）。

圖1 薄層色譜鑒別圖Figure 1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液的制備精密稱取鮮鐵皮石斛顆粒（批次180626-1）粉末1.5 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分數，下同） 甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理45 min（頻率53 kHz，功率350 W），放冷，70%甲醇補足損失質量，濾過，取濾液25 mL 于蒸發皿蒸干，殘渣加70%甲醇溶解移至5 mL 量瓶，并稀釋至刻度，即得。

2.2.2.2 混合對照品溶液取芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL 約含各對照品10 μg 的溶液。

2.2.3 共有峰匹配和已知峰的指認精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各5 μL，按“2.2.1”項色譜條件下進樣，記錄特征圖譜，并按國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012A 版）進行共有峰匹配，結果10 批樣品共匹配出6 個共有峰；經二極管陣列檢測器對6 個共有峰的光譜掃描分析（220～380 nm），所代表的成分可定性為黃酮類物質，各成分的吸收峰見表1。 其中，峰1 為芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷，峰3 為夏佛塔苷，峰5 為異夏佛塔苷；峰1 分離度較好，確認以峰1 為參比峰（見圖2、圖3）。

2.2.4 穩定性試驗取供試品溶液（批號：180626-1），在0、2、4、8、12 h 分別依法進樣，記錄共有峰的峰面積和保留時間，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值分別為1.24%～2.03%、0.45%～0.57%，表明供試品溶液在室溫下12 h 內穩定性良好。

表1 6 個共有峰的紫外吸收波長Table 1 UV absorption wavelengths of six common peaks

圖2 鮮鐵皮石斛顆粒UPLC 圖譜Figure 2 UPLC chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

圖3 鮮鐵皮石斛顆粒的特征圖譜Figure 3 Characteristics chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.2.5 精密度試驗取供試品溶液（批號：180626-1），連續進樣6 次，記錄共有峰的峰面積和保留時間，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值分別為2.12%～3.07%和0.31%～0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗取同批號顆粒（批號：180626-1），制備6 份供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖，計算各已知峰的相對保留時間的RSD 值為0.35% ～1.26%；并采用國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統2012A 版》進行相似度評價其相關系數＞0.995，表明方法重復性良好。

2.2.7 特征圖譜的建立精密吸取各批次供試品溶液5 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，以峰1 為參照峰，計算各特征圖譜共有峰的相對保留時間，結果見表2。 可見，特征峰1～6 號與S 峰（峰1）的相對保留時間規定值為1.000（峰1）、1.261（峰2）、1.309（峰3）、1.396（峰4）、1.536（峰5）、1.688（峰6），各特征峰的相對保留時間在規定值的±3%之內。

表2 鮮鐵皮石斛顆粒共有峰相對保留時間Table 2 The common peak relative retention time of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.3 非淀粉性多糖質量分數的測定

2.3.1 輔料對多糖測定的影響分別稱取鮮鐵皮石斛顆粒約1.5 g，處方量的輔料（糊精∶淀粉＝2 ∶1，質量比）適量，精密稱定，按《中國藥典》鐵皮石斛多糖含量測定項下方法操作，用紫外-可見分光光度計進行波長掃描（350 ～600 nm），記錄光譜圖，結果見圖4。 可見，輔料在488 nm 處有吸收，輔料對鮮鐵皮石斛顆粒劑的多糖測定有干擾。

2.3.2 糖化酶水解條件的考察糖化酶可特異性水解糊精、淀粉的糖苷鍵從而使它們降解為葡萄糖，參考文獻［11］選取54 ℃作為酶解溫度，考察糖化酶的加入量、酶解時間對消除輔料干擾的影響。

2.3.2.1 酶加入量稱取輔料適量（約相當于1.5 g顆粒的輔料量）6 份，精密稱定，分別置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水加熱至輔料分散均勻，冷卻至室溫后，分別加入1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0 mL（1 萬U／mL）糖化酶溶液，54 ℃保溫至樣品溶液與碘試劑反應不變藍。 冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻。 精密量取續濾液2 mL，置于15 mL 離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉速為4 000 r／min）20 min，棄去上清液，沉淀加體積分數80%乙醇洗滌2 次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。 精密量取上述溶液1 mL，按《中國藥典》鐵皮石斛多糖含量測定項下測定法顯色，在488 nm 的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，糖化酶溶液加入量為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖5。

圖4 輔料對鮮鐵皮石斛顆粒多糖測定的影響的UV 光譜圖Figure 4 UV spectrogram of the effect of excipients on the determination of polysaccharide content

2.3.2.2 酶解時間稱取輔料適量（約相當于1.5 g顆粒的輔料量）5 份，精密稱定，分別置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水中加熱至輔料分散均勻。 冷卻至室溫，加入1.5 mL 糖化酶溶液，54 ℃條件下分別保溫10、30、60、90、120 min。 冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻。 按“2.3.2.1”項下自“精密量取續濾液2 mL，置于15 mL離心管中”同法操作，以吸光度為縱坐標，酶解時間為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖6。

可見，當酶解溫度為54 ℃、酶加入量為1.5 mL、酶解時間為60 min 時，可消除輔料糊精、淀粉對測定鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉多糖質量分數的干擾。

2.3.3 溶液的制備

2.3.3.1 供試品溶液的制備取鮮鐵皮石斛顆粒，研細，取約1.5 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加50 mL 水，于沸水浴中使溶解，冷卻至54 ℃下，加10%糖化酶溶液1.5 mL，加塞，于54 ℃保溫1 h，加熱煮沸5 min，冷卻，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續濾液2 mL，置于15 mL 離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉速為4 000 r／min）20 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2 次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。 備用。

圖5 酶加入量的考察Figure 5 Investigation of the amount of enzyme added

圖6 酶解時間的考察Figure 6 Investigation of enzymatic hydrolysis time

2.3.3.2 對照品溶液的制備取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品9.06 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成90.6 μg／mL 的葡萄糖對照品溶液，備用。

2.3.3.3 陰性溶液的制備按處方量取輔料適量，精密稱定，其余操作同“2.3.3.1”項方法，即得。

2.3.4 專屬性的考察精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性溶液各1 mL，按苯酚硫酸法測定，精密加入5%苯酚溶液1 mL（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應溶劑為空白，用紫外分光光度計進行波長掃描，結果見圖7。 可見，陰性對照不干擾測定，供試品溶液、對照品溶液在488 nm 波長處有最大吸收。

2.3.5 線性關系精密量取“2.3.3.2”項下對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.7、1.0 mL 于10 mL 具塞試管中，各加水補至1.0 mL，其余步驟按“2.3.4”項下方法，以相應溶劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在488 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝10．928X- 0．010 3（r＝0.998 4），說明D-無水葡萄糖在18.12 ～90.6 μg／mL 范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

圖7 專屬性試驗光譜圖Figure 7 Spectrogram of specificity test

2.3.6 穩定性試驗精密吸取“2.3.3.1”項下供試品溶液1 mL，按“2.3.4”項下方法顯色后，于0、1、2、3、4 h 測定吸光度值，測得供試品溶液吸光度RSD 為0.33%，表明供試品溶液在4 h 內穩定性良好。

2.3.7 精密度試驗精密吸取“2.3.3.1”項下供試品溶液1 mL，按“2.3.4”項方法顯色，依法連續測定6 次，測得6 次吸光度值RSD 為0.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復性試驗精密稱取石斛顆粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”項方法制備溶液，按“2.3.4”項方法顯色后測定吸光度，代入標準曲線計算得6 份樣品平均質量分數為3.17%，RSD 為3.10%（n＝6），表明方法重復性好。

2.3.9 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的鮮鐵皮石斛顆粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”項方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液0.5 mL，置于比色管中，加入0.5 mL 已知含量的葡萄糖對照品溶液（約0.063 4 mg／mL），按“2.3.4”項方法顯色，測定吸光度，計算加樣回收率，結果見表3。 可見，平均加樣回收率為99.78%，RSD 值為2.38%，表明方法準確度良好。

2.3.10 鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉性多糖的質量分數取不同批次的鮮鐵皮石斛顆粒，按“2.3.3.1”項下方法制備溶液，按“2.3.4”項下方法測定吸光度值，通過回歸方程計算供試品溶液中非淀粉性多糖的質量分數，結果見表4。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Results of sample recovery test（n＝6）

表4 10 批鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉性多糖的測定結果Table 4 Determination of non-starch polysaccharides in fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules（n＝3）w／%

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

本文參考《中國藥典》方法建立了顆粒劑的薄層鑒別方法，結果斑點清晰，陰性無干擾。

3.2 特征圖譜的建立

鐵皮石斛中的活性成分主要為多糖、黃酮苷類成分，本研究初步建立了10 批鐵皮石斛顆粒的特征圖譜，標出6 個共有特征峰，經二極管陣列檢測器對共有峰的光譜掃描分析，所代表的成分可定性為黃酮類物質，特征圖譜的建立能更全面反映制劑的質量。

3.3 非淀粉性多糖的測定

鐵皮石斛多糖由非淀粉性多糖、淀粉性多糖、蛋白和灰分等組成，其中非淀粉性多糖占比78.21%［12］，是多糖的主要組成部分，《中國藥典》采用的是苯酚硫酸法來測定鐵皮石斛總多糖的質量分數。 鮮鐵皮石斛顆粒成型過程中加入了輔料淀粉、糊精，兩者均屬淀粉性多糖，經濃硫酸水解后產生單糖，會與苯酚反應從而影響多糖質量分數測定的準確性，因此，本文采用酶解法消除輔料對多糖測定影響的方法。 其作用原理是糖化酶能從淀粉、糊精等淀粉性多糖物質碳鏈上的非還原性末端逐漸水解α-1，4 糖苷鍵，最后水解為葡萄糖，在80%乙醇沉淀過程中與非淀粉性多糖分離，可達到去除淀粉性多糖雜質的目的。由于本法使用的對照品為葡萄糖，在加樣回收試驗中如果在第一步酶解試驗中加入對照品，對照品會溶于80%乙醇造成損失，所以只能在第二步（硫酸水解-苯酚顯色）加入以考察檢測方法的準確性。

本研究方法可同時應用于原藥材鐵皮石斛非淀粉多糖的測定，經對投料藥材非淀粉性多糖的測定，根據投料量、收得率計算顆粒的理論含量，10 批顆粒的非淀粉性多糖的轉移率分別為93.5%～102.8%，與實際工藝情況相符，進一步驗證了方法的準確性。

目前，常見的除去淀粉等物質對多糖含量測定影響的方法有AOAC Roberts 銅法、酶解法［13］等。AOAC Roberts 銅法的作用原理是在堿性條件下，銅離子選擇與具有葡聚糖結構的多糖結合生成沉淀。與酶解法相比，AOAC Roberts 銅法需要多次洗滌，操作繁瑣，結果受操作影響較大。

糖化酶是一種大分子量的糖蛋白，其中含有的組分包括葡萄糖、糖醛酸、甘露糖和半乳糖。 本研究對酶的加入量進行了考察，結果表明糖化酶用量在1.5～2.0 mL（1 萬U／mL）時可消除輔料的干擾，糖化酶加入量過多，吸光度反而升高，對測定的干擾更大。原因可能是過量的糖化酶在80%乙醇洗滌步驟中無法完全除去，因此影響實驗結果的準確性。 為了減少糖化酶用量對實驗的影響，糖化酶加入量應適度。