補益肺腎湯對哮喘模型大鼠血清及肺組織炎癥因子的影響▲

陳 宏 張 偉 蘇玉明 李 全 陳 群宋倩男 王昕宇 李美蓄 張 菁 劉 征

(1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院兒一科，哈爾濱市 150040，電子郵箱：chenhong667788@163.com；2 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱市 150040；3 黑龍江省哈爾濱市阿城區人民醫院檢驗科，哈爾濱市 150300)

哮喘是臨床常見病、多發病,其患病率和病死率一直呈逐年增高的趨勢[1]，近年來一直是國內外醫學界研究的熱點。哮喘不僅可造成患者日常活動受限，而且會導致患者的情緒、心理和社會功能等多方面的損害，對患者的健康構成嚴重的威脅[2]。由于臨床研究受倫理學的限制，通過動物實驗探索有效治療變應性哮喘的可行方法，具有重要的臨床指導意義[3]。本研究選擇SD大鼠作為研究對象，探討補益肺腎湯對哮喘大鼠氣道炎癥反應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠112只，7～8周齡，體重(200±10)g。飼養環境：溫度(23±2)℃，濕度50%，自動光控12 h/12 h明暗周期(開燈時間為8：00 AM，關燈時間為8：00 PM)，光照強度適中(約為100 lx)，動物可自由獲取食物、水和活動。

1.2 實驗動物的篩選及分組 將SD大鼠放于自制的密閉玻璃箱內，超聲霧化0.5%的磷酸組胺鹽生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內出現呼吸急促，前肢縮抬，點頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為試驗用鼠。共篩選出105只大鼠，將其按照隨機數字表法分為7組，包括正常對照組、模型組、生理鹽水組、補益肺腎湯高劑量組、補益肺腎湯中劑量組、補益肺腎湯低劑量組、異丙腎上腺素組，每組15只。

1.3 主要藥物、試劑及儀器

1.3.1 藥物：補益肺腎湯藥方組成包括黃芪20 g、丹參15 g、太子參15 g、麥冬15 g、五味子10 g、陳皮10 g、姜半夏10 g、川貝母8 g、炒蘇子8 g、烏梅15 g、地龍10 g、磁石8 g、補骨脂8 g、紫河車8 g、桃仁8 g、瓜蔞仁10 g。將上述藥物在實驗室制成煎劑，經蒸餾水常規煎煮分別濃縮至每毫升含0.5、1.0、2.0 g生藥(分別對應低、中、高劑量)，4℃保存備用，使用時可稍加熱。異丙腎上腺素(國藥準字：H31022037)購自上海大眾藥業有限公司。

1.3.2 試劑：卵清蛋白、伊文思藍均為美國Sigma公司生產，吸附無細胞百白破聯合疫苗為武漢生物制品研究所生產，生理鹽水，乙醚、丙酮、結晶氯化鋁為上海蘇燃化學試劑公司生產，氫氧化鈉為天津科密歐化學試劑公司生產，大鼠卵清蛋白特異性IgE試劑盒為美國R&D公司生產。IgE、白細胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-5和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)定量夾心酶聯免疫吸附檢測試劑盒均購自上海西唐生物有限公司，核因子κB免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3.3 儀器：ELX 800UV型酶標儀為美國Bio-Tek公司生產；LRH-250A型生化培養箱為廣東省醫療器械廠生產；UV9600型紫外/可見光分光光度計為北京瑞麗分析儀器公司生產。

1.4 動物模型建立方法

1.4.1 氫氧化鋁凝膠的配制：(1)稱取精制明礬50 g，加入蒸餾水500 mL，加熱攪拌使之完全溶解；稱取氫氧化鈉14 g，加入蒸餾水84 mL；(2)稱取酚酞0.01 g，加入95%酒精1 mL配制成1%的酚酞酒精溶液；(3)稱取氯化鋇，加入蒸餾水配置成10%的氯化鋇溶液；(4)向明礬溶液中加入配好的1%的酚酞酒精溶液0.4 mL；(5)將配制好的氫氧化鈉溶液緩慢地加入明礬溶液中，此時會有大量絮狀沉淀析出，在加入氫氧化鈉溶液的過程中要不斷地攪動，直至混合液為紅色并不再消失為止，然后任其自然沉淀；(6)當沉淀物占總體積一半后，棄去上清溶液，用蒸餾水加至原體積，并攪拌均勻，此過程重復3次，反復洗滌沉淀兩次后收集，即得氫氧化鋁凝膠。

1.4.2 模型建立：(1)致敏階段。分別于第1天、第14天，將新鮮配制的含1.0%卵清蛋白1 mg及10%氫氧化鋁凝膠1 mg的生理鹽水混懸液共1 mL，皮下注射于模型組、生理鹽水組及各治療組大鼠四肢內側，每點各0.2 mL，并腹腔注射0.2 mL，同時腹腔注射1 mL滅活百日咳桿菌5×9 ，正常對照組按照上述同樣途徑給予注射生理鹽水。(2)激發階段。模型組與各治療組，于第21天以1.0%卵清蛋白進行霧化吸入，激發哮喘，每次霧化25～30 min，連續7 d。密切觀察大鼠有無持續口唇黏膜發紺、腹肌痙攣、頻繁喘息、噴嚏、嗆咳、抓耳撓腮、煩躁不安等行為學改變則為建模成功。

1.5 給藥方法 (1)不同劑量補益肺腎湯組：于每次激發前30 min以不同劑量的補益肺腎湯灌胃給藥，以10 mL/(kg·d)灌胃。(2)生理鹽水組：于每次激發前30 min，給予同體積的生理鹽水灌胃。(3)異丙腎上腺素組：于每次激發前30 min，尾靜脈注射鹽酸異丙腎上腺素0.5 mg/kg。(4)模型組及正常對照組：均給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標 末次抗原激發30 min后頸椎脫臼處死大鼠，摘眼球取血，將血液置于抗凝管中，靜置30 min后，1 500 r/m離心15 min，取血漿，-20℃保存待檢。取完血漿后消毒大鼠胸部皮膚，逐層打開胸部皮膚及胸骨，去除部分肋骨，充分暴露肺臟，手術線結扎右肺門。沿肺門剪下右肺，磷酸鹽緩沖液漂洗后，將右肺副葉、后葉固定于4%多聚甲醛溶液中，常規脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色待檢。采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清lgE及IL-4,肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α水平，免疫組化檢測肺組織核因子κB活化情況。

1.7 統計學分析 采用SPSS 24.0統計學軟件分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 7組大鼠血清IgE和IL-4水平比較 正常對照組和各劑量補益肺腎湯組血清IgE、IL-4水平均低于模型組，補益肺腎湯低劑量組血清IgE、IL-4水平均高于中劑量組，異丙腎上腺素組血清IgE、IL-4水平高于正常對照組及補益肺腎湯高劑量、中劑量組(均P<0.05)。見表1。

表1 7組血清IgE和IL-4水平比較(x±s，ng/mL)

注：與正常對照組及各劑量補益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對照組及高劑量、中劑量補益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

2.2 7組大鼠肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平比較 正常對照組和各劑量補益肺腎湯組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平均低于模型組和生理鹽水組，補益肺腎湯低劑量組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平均高于補益肺腎湯中劑量組，異丙腎上腺素組肺組織IL-2、IL-5水平均高于正常對照組、補益肺腎湯高劑量、中劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 7組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平比較(x±s，ng/mL)

注：與正常對照組及各劑量補益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對照組及高劑量、中劑量補益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

2.3 7組大鼠肺組織TNF-α和核因子κB水平比較 正常對照組和各劑量補益肺腎湯組肺組織TNF-α和核因子κB水平均低于模型組和生理鹽水組，補益肺腎湯低劑量組肺組織TNF-α和核因子κB水平水平均高于中劑量組，正常對照組及補益肺腎湯高劑量、中劑量組肺組織TNF-α和核因子κB水平均低于異丙腎上腺素組(均P<0.05)。見表3。

表3 7組肺組織TNF-α和 核因子κB水平比較(x±s)

注：與正常對照組及各劑量補益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對照組及高劑量、中劑量補益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

3 討 論

哮喘，是一種由淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞介導的氣道慢性炎癥，常存在氣道高反應性和廣泛的可逆性氣流阻塞。哮喘的發病機制主要與 Ⅰ 型變態反應有關,主要免疫學特征是血清總IgE和特異性IgE的增高，而IgE可以介導肥大細胞脫顆粒而誘發哮喘的發作。變應原交聯引起的膜受體變位激活肥大細胞/嗜堿性粒細胞后，細胞膜磷脂甲基化作用使得胞膜的通透性增加，鈣通道開放，胞外鈣離子進入胞內，并將激活信息傳入，再激活胞內酶系列。

中醫學認為，本病與體質因素、生活環境、飲食、情志有密切關系，內因在于肺、脾、腎不足，而外因在于感受外邪、飲食失調或情志不暢等。肺、脾、腎等臟腑功能失調，津液運化輸布障礙，聚而生痰，留宿于肺，閉阻氣道，肺氣不利，血行不暢而血滯成瘀，痰瘀交結，蘊伏于內，成為哮喘之宿本。體內伏痰、遇誘因而觸發，使氣機升降出納失常，乃是本病病機之根本。臨床上，在哮喘患者中肺腎氣虛證候非常多見[4]。補腎法已不拘于“急則治標，緩則治本”的傳統原則，而廣泛運用于變應性哮喘各期[5-6]。補益肺腎湯通過多環節、多層次、多途徑治療哮喘，這種整體調節的優勢為中醫治療本病，特別是在遠期防治具有廣闊的應用前景。

研究哮喘的發病機制時，哮喘的動物模型大多是由接觸過敏原引起的過敏性氣道炎癥模型[7-8]。因此，本研究應用氫氧化鋁聯合卵清蛋白建立哮喘大鼠模型，并采用補益肺腎湯進行治療。 結果顯示，正常對照組和各劑量補益肺腎湯組血清IgE和IL-4水平，肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和核因子κB均低于模型組，且正常對照組及補益肺腎湯中劑量、高劑量組的血清IL-4、肺組織IL-2、IL-5、TNF-α、核因子κB均低于異丙腎上腺組(均P<0.05)，這提示補益肺腎湯可抑制哮喘大鼠體內的炎癥反應，且效果優于異丙腎上腺素。此外，與中劑量和高劑量補益肺腎湯組相比，低劑量補益肺腎湯組血清IgE和IL-4水平，肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α、核因子κB水平均升高(均P<0.05)，而中、高劑量組上述指標比較均無明顯差異(均P>0.05)，提示中、高劑量的補益肺腎湯的效果可能比低劑量更好。

總之，補益肺腎湯能可降低哮喘大鼠血清及肺組織的炎癥因子水平，從而減輕氣道炎癥，其中中、高劑量的效果更好。因此，在西藥常規治療的基礎上，可加用中藥補益肺腎湯治療哮喘，可起到解痙平喘、肅邪宣肺效果，從而改善患者預后明顯改善。