蘇北地區某奶牛場乳房炎頑固病原菌的分離鑒定及耐藥性分析

蔣臨正,徐 悅,林志平,馬 芳,邢光東,周明旭,5**,盧 宇,6**

(1.江蘇優源奶業產業研究院有限公司,江蘇 南京 211100;2.南京衛崗乳業有限公司,江蘇 南京 211100;3.江蘇省農業科學院 動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;4.江蘇省農業科學院 畜牧研究所,江蘇 南京 210014;5.江蘇大學 藥學院,江蘇 鎮江 212013;6.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

0 前言

奶牛乳房炎是奶牛飼養過程中最重要的疾病之一,其發病率高、致病原因復雜[1,2],不僅導致經濟上的直接損失,如產奶量暫時或永久性減少、牛奶品質降低[3],還會帶來多種間接損失,如過早淘汰產奶牛[4]、增加額外的治療成本[5.6]等。可引起奶牛乳房炎的致病菌種類繁多,包括球菌、桿菌、支原體、真菌、酵母[7]和病毒等多達150多種[8]。目前我國尚無有效的奶牛乳房炎商品疫苗,業內普遍采用抗生素進行防治[9]。但是,引起奶牛乳房炎的病原菌種類和分布情況往往與地區環境有關[10],因此不同地區甚至不同牛場中的病原菌組成及耐藥性會有所差異,難以統一用藥[11];此外,抗生素的不規范使用甚至濫用,往往導致乳品中藥物殘留及耐藥性菌株的出現,嚴重威脅食品和公共衛生安全[12]。

農業農村部于2019年7月發布了第194號公告[13]，以推進飼料“禁抗”和養殖“減抗”。在此新形勢下,對包括奶牛乳房炎在內的各類細菌疾病的預防和治療工作勢必成為奶牛場防疫工作的重點。在新型、有效的乳房炎細菌疫苗面市之前,加強牛場的飼養管理,并對牛場病原菌的流行病學和耐藥性進行調查和分析,能夠有效預防奶牛乳房炎的發生[14],且在發病后開展精準的治療,可以減少抗生素的濫用。

2019年上半年,江蘇蘇北某奶牛場在對患乳房炎奶牛使用四環素進行治療后,發現仍有部分病牛未能痊愈;牛場獸醫推測其致病菌具有耐藥性并且很有可能是金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,因此更換林可霉素進行繼續治療,但并無顯著效果。本研究團隊對該牛場2019年6～10月期間已接受過抗生素(四環素)治療的共26頭奶牛進行了奶樣的采集和病原菌分離鑒定和藥敏性分析,及時探清了該牛場可能存在的耐藥菌株以及耐藥類型,可為該牛場后續臨床用藥提供理論依據,同時分離出的菌株也可為相關疫苗研發提供寶貴的生物材料。

1 材料和方法

1.1 培養基和主要試劑

胰蛋白酶(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)購自Oxoid公司;瓊脂(Agar)MH培養基購自南京翼飛雪生物科技有限公司; ExTaq (10 U/L)、dNTP均購自TaKaRa公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;藥敏試紙購自杭州天和生化試劑有限公司。

1.2 奶樣采集

對已接受抗生素治療1周的26頭患乳房炎奶牛進行奶樣的采集。在采樣前24 h停藥,共采集生牛奶樣品31份。使用溫水清潔乳房和乳頭,再用碘液對乳頭進行消毒。在進行無菌取奶時,棄去前三把奶,收集奶樣至15 mL無菌離心管中,每管取乳5 mL待檢。

1.3 菌株的分離和純化

將奶樣置于37 ℃搖床培養6 h,轉速設置為180 r/min。吸取10L樣品分別在TSA和血平板上劃線分離培養。將平板置于37 ℃培養箱過夜,觀察細菌菌落的生長情況,并挑取不同形態的菌落再次劃線純化培養。將純化后的菌落接種于TSB或者THB培養液中進行純培養8 h,取菌液備用或凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 細菌基因組DNA的提取

使用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取上述備用菌液的基因組DNA。按照說明書的步驟提取細菌基因組DNA,最后使用50L超純水沖洗柱體,溶解備用。

1.5 分離菌的測序鑒定

本次鑒定均使用16S rDNA引物進行擴增,其中16SDNA-F的序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16SDNA-R的序列為GGCTACCTTGTTACGACT。以按上述步驟提取的不同的細菌基因組作為模板,對細菌的16S rDNA進行擴增[9],引物均由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗的方法[15]如下:將待檢細菌的單菌落接種于LB液體培養基，于37 ℃恒溫過夜培養；以5000 r/min的轉速離心LB液體培養基10 min，然后棄取上清,用PBS重懸并調整菌液濃度(OD600≈0.1或0.5個麥氏濁度)。使用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于MH平板上,并在室溫下干燥5 min。將9種藥敏紙片分別輕貼在MH瓊脂平板上,不同紙片相距15～20 mm,于37 ℃恒溫下培養,在培養24 h后測量抑菌環直徑。藥敏結果的判定參考美國臨床實驗室標準化協會所制定的標準CLSI M100 2018[16]。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

在6～10月期間,從該牛場共采集已發病并經四環素治療的奶牛奶樣31份,共分離細菌12株,以W1～W12表示:其中有10份奶樣分離出細菌1株,1份奶樣中分離出細菌2株,檢出率35.4%。純化的細菌經革蘭氏染色并鏡檢,發現共有7株革蘭氏陰性菌(占比7/12,58.33%),5株革蘭氏陽性菌(占比5/12,41.67%)。

2.2 細菌種、屬的鑒定

通過提取細菌基因組,對其PCR產物進行測序后得到16S rDNA序列,將序列導入BLAST進行比對,以確定菌株的種、屬,鑒定結果見表1。在本次檢測中,共檢出大腸桿菌屬細菌3株、肺炎克雷伯菌屬細菌2株、停乳鏈球菌屬細菌1株,分別占分離菌株數的25.00%、16.67%、8.33%。

表1 分離菌株的種、屬分布

2.3 分離菌株的耐藥性

藥敏試驗選取9種牛場臨床上常用的抗生素,檢測分離菌株的耐藥性,結果如表2所示。其中,分離出的3株大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、林可霉素以及頭孢喹肟均顯示出多重耐藥性;W1和W2株對鏈霉素耐藥,而W2和W3株還對四環素和土霉素耐藥。2株肺炎克雷伯菌對青霉素、氨芐西林和林可霉素呈多重耐藥,而對四環素中度敏感。銅綠假單胞菌W9的耐藥性較強,對青霉素、氨芐西林、林可霉素、四環素、土霉素和頭孢喹肟均表現出多重耐藥,對鏈霉素和卡那霉素也僅是中度敏感,只有對慶大霉素表現敏感。產色葡萄球菌W12對林可霉素、四環素和土霉素多重耐藥。松鼠葡萄球菌W11對林可霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環素、土霉素、慶大霉素和頭孢喹肟均耐藥,僅對青霉素類藥物敏感。

12株分離菌對9種常用獸用抗生素的耐藥性中,對林可霉素的耐藥率最高,達到83.3%(10/12);而對卡那霉素和慶大霉素的耐藥率均最低,僅8.3%(1/12)。

表2 細菌分離株對9種常用獸用抗生素的耐藥性

注:“S”代表高度敏感；“M”表示中度敏感;“R”表示耐藥。耐藥性判定標準為CLSI M100 2018。

3 討論

奶牛乳房炎一直是困擾國內外奶業生產的重要疾病,由于國內目前暫無有效的商業疫苗使用,大部分牛場主要使用抗生素藥物防治乳房炎。但是,引起奶牛乳房炎的致病菌繁多,不同種屬、不同菌株的耐藥性各有異同,增加了臨床用藥的困難。而盲目使用各類抗生素,不僅治療效果有限,而且容易造成細菌耐藥性的進一步增強,從而孵育牛場的“超級細菌”。

本研究中的奶牛場長期使用四環素治療奶牛乳房炎;在2019年上半年逐漸出現病牛經四環素或林可霉素治療后療效均不佳的情況。本研究團隊連續4個月在該場采集到26頭經四環素治療1周的患病奶牛的奶樣31份,對其中可能存在的耐藥菌株進行了分離和鑒定，結果從35.4%(11/31)的奶樣中分離到細菌,比例較高,說明四環素的治療對分離菌株的效果不好。通過對分離純化的細菌進行16S rDNA序列比對,發現菌株包括大腸桿菌3株,肺炎克雷伯菌2株,葡萄球菌2株(松鼠葡萄球菌1株,產色葡萄球菌1株),其他分別為鮑曼不動桿菌1株,停乳鏈球菌1株,銅綠假單胞菌1株,短小芽孢桿菌1株以及腸球菌1株；其中有1份奶樣同時分離出肺炎克雷伯菌和大腸桿菌,存在混合感染的情況。

大腸桿菌是奶牛乳房炎的主要致病菌[17]。Zhang D X等[18]從遼寧7個牛場分離出393株菌,大腸桿菌占20.01%;王丹等[19]從臨床型和隱性乳腺炎奶樣中分離病原菌,大腸桿菌檢出率達24.25%,且其主要對青霉素、克林霉素、萬古霉素和利福平耐藥,耐藥率達81.25%～100.00%。近年來的流調數據顯示,肺炎克雷伯菌也成為江蘇地區奶牛乳房炎的主要致病菌之一[20];該細菌侵入乳腺后,可黏附和侵襲乳腺上皮細胞,可在細胞內存活,難以通過抗生素治療。但本研究并未分離到金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌等主要隱性乳房炎的病原菌。另外值得關注的是,鮑曼不動桿菌在臨床上的分離率和耐藥率非常高,更被冠名“革蘭氏陰性桿菌的MRSA”[21]。葛東紅等[22]從生牛乳中分離到鮑曼不動桿菌,對頭孢唑啉、呋喃妥因、萬古霉素和克林霉素表現出多重耐藥,在攻毒小鼠后可造成60%的死亡率。

本研究分離出大腸桿菌W1和W3的奶樣有明顯的血乳情況。經藥敏試驗鑒定,12個菌株對四環素類藥物(包括四環素和土霉素)的耐藥率達到41.6%(5/12),剩余7株細菌也對該類藥物呈現中度敏感,可能是因為長期使用該類藥物導致細菌耐藥性增強,從而造成該牛場此前使用四環素治療時效果不佳。當牛場獸醫在發現四環素效果有限時,首先應考慮更換其他抗生素,尤其是針對較難清除的革蘭氏陽性菌的抗生素。但本次12株細菌對林可霉素的耐藥率達到83.3%,對3代頭孢類藥物頭孢喹肟的耐藥率達58.3%,對更常用的青霉素類藥物的耐藥率也有50.00%(6/12),這一方面說明了牛場細菌種屬和耐藥性能的復雜性,另一方面也說明了牛場定期針對本場流行病原菌藥敏鑒定工作的必要性。對于牛場存在的一些頑固病原菌,盲目用新藥、廣譜藥有時并不能達到快速治療的效果,反而會延長整體治療周期,耽誤治療的最佳時機,使奶牛乳房炎的發病情況愈發嚴重。通過本研究的耐藥性分析,本奶牛場病原菌對卡那霉素和慶大霉素的耐藥率最低,均僅8.3%。考慮仍有部分菌株對卡那霉素和慶大霉素呈現中度敏感,建議牛場在今后治療乳房炎病牛中將兩種抗生素交叉使用,防止細菌耐藥性的生成。