美容杜鵑人工種子制備關鍵技術及萌發研究

李小玲，趙義蘭，華智銳

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛726000)

美容杜鵑(Rhndodendroncalophytum)屬于杜鵑花科、杜鵑花屬(RhododendronLinn)的植物，具有較高的園林觀賞及應用價值。隨著城市化進程的推進及旅游業的發展，人類不合理的采挖導致杜鵑花資源破壞及流失，加之杜鵑花生長緩慢，常用的扦插、嫁接等無性繁殖方式成苗率不高[1]，且都會受到諸如季節氣候、母株材料等很多條件的影響，難以擴大規模、進行商品化操作[2]。因此，種子繁殖成為杜鵑花規模化栽培及繁育新品種的主要方法，但杜鵑種子極為細小，萌發率又低，很難進行大規模栽培[3]，而人工種子技術作為一門新興技術為杜鵑花的栽培提供了一條新途徑。

人工種子又稱合成種子，是指將離體培養產生的胚狀體、不定芽及分生組織包埋在具有一定營養成分及保護作用的人工種皮內，在人為提供的培養條件下能夠發芽成苗的顆粒體[4]。近年來,人工種子的包埋繁殖體已不僅僅局限于體細胞胚，即人工種子的制作已從單一的體細胞胚發展到能夠發育成完整植株的分生組織，如愈傷組織、原球莖、塊莖、不定芽、腋芽等[5-6]，所以當采用分生組織作為包埋繁殖體制作人工種子獲得成功后便迅速成為熱點，也使得人工種子的研究從模式植物轉向具有重要經濟價值的糧食作物和藥用植物。目前對杜鵑人工種子的制作研究較少，本試驗以美容杜鵑腋芽為材料，研究了人工種子制作方法及萌發條件，旨在為美容杜鵑人工種子的研究提供理論依據，為杜鵑的規模化生產提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美容杜鵑(Rhndodendroncalophytum)腋芽于2019年4月上旬采自商洛市鎮安縣國家木王林場海拔1500 m左右的杜鵑花景區。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 選擇美容杜鵑帶腋芽莖段，經流水沖洗數小時，后置于超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，用無菌水沖洗2～3次，再用0.1% HgCl2消毒8 min，最后用無菌水沖洗3～5次，將消毒好的莖段切成2～4 mm作為人工種子包埋繁殖體備用。

1.2.2 人工種子制作 人工種子制作方法采用滴注法，具體操作步驟如下：將切好的外植體小段懸浮于半凝膠狀態的2%～4%海藻酸鈉溶液中，充分搖勻混合5～8 min后，用膠頭滴管吸取單個莖段，滴于2% CaCl2溶液中進行離子反應，即得人工種子。

1.2.3 人工種子萌發 撈出人工種子，用無菌水沖洗2～3次，用濾紙吸干表面水分，分別播種于不加激素的MS培養基上，加有激素的MS培養基和鋪有用無菌水浸潤濾紙的培養皿中。培養溫度設為(25±1) ℃，光照時間為12 h/d，光照強度為1000～2000 lx；20 d后觀察人工種子萌發率。

以上所有美容杜鵑人工種子萌發試驗中，以突破種皮2 mm視為萌發，萌發率=萌發的人工種子數/播種的人工種子總數×100%。

1.2.4 不同人工胚乳及人工種皮配方對人工種子萌發的影響 選用1/2 MS液體培養基與不同濃度激素配比(0.2∶0.1、 0.3∶0.1、0.4∶0.1激素單位為mg/L)NAA∶GA3(A)及3%、4%、5%的海藻酸鈉(B)，與2%殼聚糖組成人工胚乳配方；與0～0.2 mg/L苯甲酸鈉(C)、0～0.2 mg/L多菌靈(D)及 2%、8%、10%的CaCl2(E)組成種皮配方；以10、15、20 min的不同離子反應時間進行5因素3水平的正交試驗(表1)。將制作好的人工種子播于MS培養基中，每個處理為10粒，重復3次。放于無菌培養室培養，溫度設為(25±1) ℃，光照強度為1000～2000 lx，光照時間12 h/d；20 d后統計不同人工胚乳組分下人工種子的萌發數。

表1 正交試驗因素L18(35)水平表

1.2.5 不同海藻酸鈉濃度及離子交換時間對人工種子成形的影響 將3%、4%、5%的海藻酸鈉溶液分別與2%、8%、10% CaCl2溶液進行離子交換反應，反應時間設10、15、20 min，觀察人工種子成形情況。

1.2.6 不同萌發基質對人工種子萌發及成苗的影響 將制作好的人工種子分別播種于不加激素的MS培養基和加有激素的MS培養基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用無菌水浸潤濾紙的培養皿和用1/2 MS浸潤濾紙的培養皿，每個處理為10粒，重復3次。放于無菌培養室培養，溫度設為(25±1) ℃，光照時間設每天12 h，光照強度設1000～2000 lx；20 d后統計人工種子萌發率及成苗率。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度以及離子交換時間對人工種子成形的影響

經預試驗發現2%海藻酸鈉+2% CaCl2種子成形不理想，表現為種子顆粒不均勻，看似成形，實際撈出即破，無彈性，種子成形時間長，易粘連且易碎(圖1a～1c)。故增加海藻酸鈉濃度到5%，并將CaCl2濃度提高到8%、10%、15%，并根據孫筱筠等[7]的研究結果，將人工種子胚乳成分稍加完善，以添加1.5%的可溶性淀粉來增加人工種子透氣性，并且對一次成形不好的人工種子進行二次包埋。經調整后發現15%的CaCl2濃度太高，種子硬度大，無彈性且透明度低(圖1d～1f)因此舍棄這兩個濃度，后續試驗按照海藻酸鈉濃度2%～5%，CaCl2濃度為2%、8%、10%來進行。由表2可知不同海藻酸鈉濃度和CaCl2濃度及離子反應時間，均對人工種子成形有較大影響，當海藻酸鈉濃度過低時，人工種子不能成球形且形狀不規則，較軟，塌扁并易粘連，無彈性，種子成形時間長；而當海藻酸鈉濃度過高時，雖然縮短了成形時間，但人工種子拖尾現象嚴重，硬度大且透明度低，渾濁[8,9]。本試驗結果表明，4%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應15 min和3%海藻酸鈉溶液在2%、8% CaCl2溶液中反應20 min形成的人工種子呈透明狀，顆粒均勻，富有彈性(圖1g～1i)。

表2 不同海藻酸鈉濃度及離子交換時間對人工種子成形的影響

a、b、c分別為2%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應10、15、20 min；d、e、f分別為5%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應10、15、20 min；g、h、i分別為4%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應15 min，3%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應20 min，3%海藻酸鈉溶液在8% CaCl2溶液中反應20 min。

圖1 海藻酸鈉濃度以及離子交換時間對人工種子成形的影響

2.2 不同人工胚乳及人工種皮配方對人工種子萌發的影響

以1/2 MS液體培養基作為包埋溶劑，選用3水平5因素的正交試驗L18(35)(表1)，將不同的人工胚乳成分與不同的人工種皮成分進行離子反應10、15、20 min。由表3[10]中的極差分析可知：5個因素對于美容杜鵑人工種子萌發的影響程度依次為B>E>D>C>A，即海藻酸鈉>CaCl2>多菌靈>苯甲酸鈉>激素比(NAA∶GA3)；海藻酸鈉、CaCl2、多菌靈對人工種子萌發率的影響程度均達到顯著水平，其次是苯甲酸鈉、NAA與GA3； NAA與GA3的激素配比對人工種子萌發影響最小；但根據后期萌發結果可知激素對人工種子萌發起到促進作用，但促進效果不顯著；最優組合為A2B2C3D3E1，這與本次試驗結果一致。

綜合分析，最佳人工胚乳與種皮配方為4%海藻酸鈉+0.2 mg/L多菌靈+0.2 mg/L苯甲酸鈉+NAA∶GA3(0.3∶0.1)+2% CaCl2；經后期萌發結果可知該組合配方制作的人工種子萌發率達87%以上。

表3 正交因素對人工種子萌發分析表

2.3 不同萌發基質對人工種子萌發的影響

本試驗將制作好的人工種子分別播于普通MS培養基，加有激素的MS培養基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用無菌水浸潤濾紙的培養皿和用1/2 MS浸潤濾紙的培養皿中。結果表明：用1/2 MS浸潤濾紙的培養皿中的人工種子在14 d左右逐漸出現污染情況，種子無失水，20 d時的萌發率達31%；而用無菌水浸潤濾紙作為對照培養的培養皿中的人工種子，在12 d左右種子則逐漸失水變干，但并無污染情況，且20 d時的萌發率為20.3%(圖2a～2b)；經二次包埋的人工種子雖也會失水，但失水情況較一次包埋減輕許多，在15 d左右時種子逐漸失水，并且萌發率較一次包埋有所提高，說明二次包埋有效地降低了種子失水率，提高了萌發率；培養基組的人工種子則并無太大差異，加有激素的MS培養基中的人工種子在10 d左右開始萌發，20 d時萌發率達87%，而普通MS培養基中的人工種子萌發相對較慢，在12 d時逐漸開始萌發，20 d時的萌發率達84%(圖2c～2d)。對4種不同萌發基質的萌發效果進行方差分析(表4)可知，美容杜鵑人工種子在加激素的培養基中萌發率顯著高于其它處理組，其次是不加激素的MS培養基，而用1/2 MS液體浸潤濾紙的培養皿中的人工種子萌發效果最不顯著；加激素的培養基是人工種子的最適萌發基質。

3 討論

本試驗采用帶腋芽莖段制作人工種子有許多優點：可避免體細胞胚胎發生的變異，且取材容易，成本低[11]；海藻酸鈉凝膠包埋系統具有無毒、使用方便、易成膠、價格低廉等優點[12,13]。本次試驗利用海藻酸鈉作為包埋基質對美容杜鵑進行了包埋處理，得出人工胚乳的最佳制作條件為4%海藻酸鈉與2% CaCl2水溶液離子反應15 min，形成的人工種子顆粒均勻，軟硬適中，富有彈性。這與張明生等[14]的研究結果一致，但與已報道的張建彬等[15]的大花蕙蘭類原球莖的人工種子的制作中海藻酸鈉的濃度有所差異。同時從本次試驗還可看出海藻酸鈉作為包埋系統的一些缺點，如：保水性較差，易使營養物質流失，同時膠粒在空氣中容易失水變干，致使人工種子在后期的培養中萌發受阻，這與秦自清等[16-18]的研究結果一致。孫筱筠等[7]研究發現在海藻酸鈉凝膠系統中加入淀粉形成混合包埋基質，不僅改善了單一海藻酸鈉凝膠系統所造成的保水性差的問題，同時也提高了人工種子的萌發率。本試驗吸取前人的經驗，在人工胚乳成分中添加了可溶性淀粉，結果表明加入淀粉后能有效增加人工胚乳的保水性并提高人工種子的萌發率；分析原因可能是淀粉分子中疏松的多孔結構改變了海藻酸鈉的緊密結構，增加了海藻酸鈉凝膠的透氣性和保水性，從而提高了人工種子萌發率。同時曾穎蘋等[19]研究發現人工種子的萌發率還與其失水率有關。本次試驗將部分人工種皮進行了二次包埋，主要是為了降低種子的失水率，并與一次包埋種子形成對照，結果表明二次包埋明顯降低了失水率，利于種子萌發。

a.培養皿組變干的人工種子；b.人工種子在培養皿中萌發；c.培養基組污染的人工種子；d.人工種子在培養基中萌發。圖2 不同萌發基質對人工種子萌發率的影響

表4 不同萌發基質下人工種子萌發率差異

注:同列數據后不同字母表示差異顯著。

本次試驗發現在不同萌發基質中，1/2 MS浸潤濾紙的培養皿中的人工種子在14 d左右逐漸出現污染情況，種子無失水，20 d時的萌發率達31%；而用無菌水浸潤濾紙的培養皿中的人工種子，在12 d左右時種子逐漸失水變干，但并無污染情況，分析其原因可能是培養皿密封不嚴，加之1/2 MS高營養物濃度導致增加染菌幾率，從而降低人工種子萌發率。作為調整，后續培養皿組試驗均用封口膜封住培養皿邊緣來減少染菌情況，但經后期試驗發現，此現象并無減少。加有激素的MS培養基中的人工種子在10 d左右開始萌發，20 d時萌發率達87%，而普通MS培養基中的人工種子萌發較慢，在12 d時逐漸開始萌發，20 d時的萌發率達84%，分析原因是激素對人工種子的萌發起到促進作用，但不明顯。通過上述正交試驗因素分析也可得出此結論，這與薛建平[20]對半夏人工種子的研究結果一致。

人工胚乳為人工種子的萌發提供營養物質，研究發現在人工胚乳中添加植物激素、碳水化合物、殺菌劑、防腐劑可提高人工種子萌發率[21-22]。本試驗得出殺菌劑多菌靈影響人工種子萌發的效果達到顯著水平，但在本試驗中雖然殺菌劑和防腐劑會起到降低污染率的作用，但仍然存在污染，可能是操作過程不嚴謹，導致染菌，因此人工種子制作過程要嚴格無菌才能保證人工種子的質量。

綜上分析，人工種子制作及培養過程中，失水和污染是影響種子萌發的最重要兩大制約因素，因此人工種子制作過程中人工外膜和胚乳成分的改進還是有待突破的難題，雖然目前已有很多良好的復合型包裹材料，如Elvax4260、半疏水聚合物等[23]。但考慮到有些制膜程序復雜，成本高及胚乳的不保水、機械性能差、易粘連等問題，所以人工種子外膜及胚乳成分這一領域仍有待深入研究。