EMS誘變對(duì)茄子種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)的影響

尚 靜,張 會(huì),王圣潔,王小玲,姜守陽(yáng),查丁石,吳雪霞*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 設(shè)施園藝研究所,上海 201403;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命科學(xué)院,上海 201306;3.上海乾德種業(yè)有限公司,上海 200235;4.上海農(nóng)科種子種苗有限公司,上海 201106)

化學(xué)誘變育種是始于20世紀(jì)初的一種作物育種技術(shù),通過(guò)誘變劑對(duì)植物DNA造成損傷和錯(cuò)誤修復(fù)等,產(chǎn)生后代較為穩(wěn)定的遺傳突變體[1]。對(duì)分離后代進(jìn)行突變體的選擇和鑒定,育成可直接或間接利用的遺傳穩(wěn)定的品種[2]。化學(xué)誘變可操作性強(qiáng),效率高,且成本低,無(wú)需特殊設(shè)備,因而已成為近幾年來(lái)應(yīng)用最為廣泛的誘變技術(shù)[3]。化學(xué)誘變劑有1000多種。與其它誘變劑相比,甲基磺酸乙酯(EMS)具有誘變特異性強(qiáng)、頻率高、范圍廣,且多產(chǎn)生顯性突變體,易于篩選等特點(diǎn),成為公認(rèn)的應(yīng)用最廣、效果最好的化學(xué)誘變劑[4]。目前,EMS誘變技術(shù)在植物中應(yīng)用廣泛,現(xiàn)已在擬南芥[5]、小麥[6]、水稻[7]、馬鈴薯[8]、大豆[9]、油菜[10]等作物中構(gòu)建了突變體庫(kù)。這些突變體庫(kù)不僅為深入研究基因組學(xué)提供了優(yōu)良的材料,也為培育新品種提供了豐富的遺傳資源。

茄子(SolanummelongenaL.)屬茄科,原產(chǎn)于印度,是亞熱帶和熱帶地區(qū)常見(jiàn)蔬菜。茄子雖然形態(tài)多樣,但其栽培種經(jīng)過(guò)特定方向的不斷選育,遺傳背景相對(duì)狹窄[11]。此外，由于不同地區(qū)間的種質(zhì)資源不斷交流,現(xiàn)在茄子種質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重,遺傳多樣性減少[12]。因此加強(qiáng)茄子種質(zhì)資源創(chuàng)新,擴(kuò)展其遺傳基礎(chǔ)對(duì)茄子新品種的選育具有重要意義。前人研究表明,通過(guò)化學(xué)和物理方法誘導(dǎo)突變是增加茄子遺傳多樣性的高效方法[13]。茄子突變體是培育新品種的潛在材料[14]。本研究以穩(wěn)定遺傳的茄子自交系為材料,探究了不同EMS濃度對(duì)茄子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)的影響,從而獲得了適宜的誘變處理；在此誘變基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步測(cè)定了茄子幼苗在兩個(gè)半致死EMS處理下的生理指標(biāo),為建立茄子EMS誘變體系,進(jìn)一步利用突變體材料進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試茄子材料為遺傳穩(wěn)定的茄子高代自交系‘8果’,由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供。其性狀表現(xiàn)為:萼片綠色,果皮紫黑色,果實(shí)長(zhǎng)棒形,光澤強(qiáng),產(chǎn)量高,抗病性強(qiáng),商品性?xún)?yōu)。本試驗(yàn)在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所完成。

選取顆粒飽滿(mǎn)、無(wú)病變的茄子種子進(jìn)行EMS誘變。EMS 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(產(chǎn)品號(hào)M880-5g),其為水劑,微溶于水。用于化學(xué)誘變劑溶劑配制的化學(xué)藥品為常規(guī)無(wú)機(jī)試劑 Na2HPO4和NaH2PO4,均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,產(chǎn)品純度為化學(xué)純。

磷酸緩沖溶液的準(zhǔn)備:Na2HPO4配制500 mL溶液,需要35.82 g,命名為 A；NaH2PO4配制500 mL溶液,需要15.605 g,命名為 B。磷酸緩沖溶液(A∶B=61∶39)現(xiàn)配現(xiàn)用,用NaOH溶液將pH值微調(diào)至7。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EMS誘變條件篩選,篩選半致死處理 試驗(yàn)設(shè)置EMS濃度6個(gè)、浸泡時(shí)間5個(gè),共30個(gè)處理(見(jiàn)表1),每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)供試100粒種子。本試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[15]中的方法并稍作修改,具體如下:

(1)誘變前處理:在25 ℃下將種子用水浸泡4～6 h，然后用吸水紙吸干，待用;

(2) 6個(gè)濃度EMS溶液的配制:在50 mL離心管中分別加入0、75、150、225、300、375 μL EMS溶液,再分別加入磷酸緩沖液15.000、14.925、14.850、14.775、14.700、14.625 mL,配制成體積分?jǐn)?shù)分別為 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的EMS溶液;

(3)浸泡誘變處理:將經(jīng)誘變前處理的待用種子放入配制好的EMS溶液中,將離心管封口并用錫紙包裹避光,防止EMS誘變劑見(jiàn)光分解。將離心管放于26 ℃、100 r/min的搖床內(nèi)充分搖晃,每個(gè)EMS誘變濃度對(duì)應(yīng)5個(gè)處理時(shí)間(4、6、8、10、12 h);

(4)誘變完成后處理:取出搖床中的離心管,先加入10 mL濃度為1 mol/L的Na2S2O3終止反應(yīng);再用20 mL濃度為0.100 mol/L的Na2S2O3洗3遍,每次輕搖5 min,倒掉溶液;最后用自來(lái)水沖洗3～4 h,洗凈種子表面的殘留物;

(5)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽:將經(jīng)誘變處理后的種子分別放入裝有吸水紙的發(fā)芽盒中,加入無(wú)菌水,用吸水紙覆蓋種子,避光放置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱里過(guò)夜催芽,直至種子發(fā)芽,期間每天記錄種子發(fā)芽數(shù)。在第10天時(shí)統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況,計(jì)算種子發(fā)芽率,達(dá)到空白對(duì)照的發(fā)芽率50%的EMS處理劑量和處理時(shí)間為最佳處理,該處理為半致死EMS處理。

1.2.2 半致死EMS誘變處理對(duì)茄子幼苗生長(zhǎng)的影響試驗(yàn) EMS與水作用易產(chǎn)生有毒的化合物,會(huì)對(duì)植物造成生理?yè)p傷,導(dǎo)致植株不育[16]。根據(jù)1.2.1中的試驗(yàn),篩選出0.5% EMS處理6 h和1.0% EMS處理4 h為最佳誘變處理,分別用S1和S2表示,即這2個(gè)處理對(duì)茄子種子產(chǎn)生誘變作用,又不會(huì)造成嚴(yán)重的毒害。選取0% EMS處理4 h的種子作為空白對(duì)照(CK),下文中提到的S1、S2、CK均與此處一致。在誘變處理第10天時(shí)計(jì)算不同處理的發(fā)芽率,對(duì)照(CK)供試100粒種子,重復(fù)6次；S1、S2每個(gè)處理供試200粒種子,6次重復(fù)。在第14天時(shí)測(cè)定幼苗的總長(zhǎng)、幼苗鮮重,并取樣測(cè)定幼苗的相關(guān)生理指標(biāo),每個(gè)處理10株,重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 分別利用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗的株高(子葉節(jié)至生長(zhǎng)點(diǎn))、莖粗；吸干水分后稱(chēng)量幼苗鮮重。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(MDA)含量、超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率和H2O2含量,超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性,脯氨酸(Pro)含量和可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均參照Wu等[17]的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 7.5軟件繪圖,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)平均數(shù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理對(duì)茄子種子萌發(fā)的影響

由表1和圖1可見(jiàn)：當(dāng)EMS濃度為0%時(shí),茄子種子發(fā)芽率隨處理時(shí)間的增加變化不明顯,均在80%以上,故在分析半致死EMS處理對(duì)茄子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí),以0% EMS處理4 h為空白對(duì)照(CK)；當(dāng)EMS濃度為0.5%和1.0%時(shí),發(fā)芽率隨處理時(shí)間的增加均呈下降趨勢(shì)；當(dāng)EMS濃度≥1.5%時(shí),處理時(shí)間從4 h至12 h,種子均不發(fā)芽。當(dāng)EMS處理時(shí)間一定時(shí),在EMS濃度0%～1.0%范圍內(nèi),茄子種子的發(fā)芽率隨著EMS濃度的增加均呈降低趨勢(shì)。0.5% EMS處理6 h和1.0% EMS處理4 h,種子發(fā)芽率分別為53.12%、44.67%,約為CK的種子發(fā)芽率的1/2。因此,選擇0.5% EMS處理6 h、1.0% EMS處理4 h為茄子種子的最佳誘變處理。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 此部分做了5次重復(fù)試驗(yàn),雖然每次重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果有所差異,但基本趨勢(shì)一致。

表1 不同EMS誘變處理下茄子種子的萌發(fā)率

%

圖1 不同EMS誘變處理對(duì)茄子種子萌發(fā)的影響

2.2 半致死EMS處理對(duì)茄子種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

從表2可以看出,不同半致死EMS處理對(duì)茄子種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響程度不同。與CK相比,S1和S2處理的種子發(fā)芽率顯著降低,分別降低了16.83和30.00個(gè)百分點(diǎn);S1和S2處理對(duì)茄子的幼苗長(zhǎng)度均無(wú)顯著影響;S1處理對(duì)幼苗的鮮重?zé)o顯著影響,但S2處理使茄子幼苗鮮重顯著降低,較CK降低了14.30%；在S1和S2處理間茄子種子發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)度和幼苗鮮重均無(wú)顯著差異。

2.3 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗MDA含量、O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

由表3可知：與CK相比,在S1處理下的茄子幼苗丙二醛(MDA)含量、超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率和H2O2含量均無(wú)明顯變化；S2處理的上述指標(biāo)均較CK顯著增加,分別增加了26.04%、13.23%、28.91%；S2處理的上述指標(biāo)均顯著高于S1處理。

2.4 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗酶活性的影響

由表4可以看出：與CK相比,S1處理的茄子幼苗超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性無(wú)顯著變化,過(guò)氧化物酶(POD)活性顯著提高；S2處理的SOD、POD和CAT活性均較CK顯著提高,分別提高了14.39%、25.31%和18.41%；在S1和S2處理間SOD活性和POD活性無(wú)顯著差異,但S2處理的CAT活性顯著高于S1處理。

2.5 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

從表5可以看出：與CK相比,S1和S2處理下茄子幼苗脯氨酸含量均無(wú)顯著變化;S1處理下茄子幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著變化；S2處理使茄子幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高,較CK升高了36.97%；在S1和S2處理間可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著，但脯氨酸含量差異不顯著。

表2 半致死EMS誘變處理對(duì)茄子種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

注:同列數(shù)據(jù)后附不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)5%顯著水平。下同。

表3 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗MDA含量、O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量(鮮重)的影響

表4 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗酶活性的影響

表5 半致死EMS處理對(duì)茄子幼苗脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

3 討論

不同植物對(duì)EMS的耐受程度不同,因此對(duì)EMS濃度和誘變時(shí)間進(jìn)行篩選是構(gòu)建茄子EMS突變體庫(kù)的前提。任婷婷等[18]的研究表明,EMS 濃度越高、誘變時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)植物組織造成的傷害越大,產(chǎn)生的突變也會(huì)越多,但植物也會(huì)因?yàn)閾p傷過(guò)度而死亡;反之,誘變劑量太低和誘變時(shí)間不夠則會(huì)導(dǎo)致突變減少,構(gòu)建飽和突變體庫(kù)需要的群體就會(huì)增大,從而會(huì)增加成本,降低篩選效率。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：當(dāng)EMS濃度(>0%)一定時(shí),茄子種子的發(fā)芽率隨處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì);當(dāng)處理時(shí)間一定時(shí),隨著EMS濃度的增加,茄子種子的發(fā)芽率呈遞減趨勢(shì),且當(dāng)濃度≥1.5%時(shí),種子均不發(fā)芽,并出現(xiàn)不同程度的腐爛,表明過(guò)高的EMS濃度會(huì)對(duì)茄子種子產(chǎn)生毒害作用，從而抑制其萌發(fā),最終致其死亡。這與張雨桐等[19]在對(duì)直立型扁蓿豆種子進(jìn)行誘變時(shí)得出的結(jié)論相似。

半致死劑量既是確定試驗(yàn)材料對(duì)EMS敏感性的主要指標(biāo),也是EMS化學(xué)誘變劑量的應(yīng)用參考,以種子的相對(duì)發(fā)芽率為50%時(shí)的誘導(dǎo)劑量為半致死劑量[20]。在茄科蔬菜中,汪斌[21]在用甲基磺酸乙酯(EMS)對(duì)加工番茄進(jìn)行誘變時(shí),根據(jù)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分析認(rèn)為:EMS誘變加工番茄“JW9”的半致死劑量為3%處理10 h。周書(shū)棟等[22]在分析EMS處理對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)1.0% EMS處理下的辣椒種子發(fā)芽率和幼苗存活率均接近半致死劑量下的。在本試驗(yàn)中,用0.5% EMS處理6 h和用1.0% EMS處理4 h,茄子種子的發(fā)芽率約為對(duì)照組發(fā)芽率(82.67%)的1/2。

EMS對(duì)植物的誘變作用可能會(huì)降低植物體對(duì)活性氧(O2·-、H2O2)的防御能力,對(duì)種子的毒害可能是由活性氧過(guò)剩導(dǎo)致。在本試驗(yàn)中的S1處理下,茄子種子MDA含量、O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量與CK相比均無(wú)明顯變化;但S2處理的上述指標(biāo)均顯著增加,表明膜脂過(guò)氧化程度加劇,細(xì)胞膜透性增加,細(xì)胞內(nèi)含物流失加劇。

超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶,受到的毒害作用越深,活性氧含量越高,抗氧化酶活性相應(yīng)增高,用于清除活性氧,這是植物體對(duì)自身的重要保護(hù)機(jī)制[23]。與CK相比,S1處理的茄子幼苗SOD和CAT活性無(wú)顯著變化,POD活性顯著提高,S2處理的上述3種酶活性均顯著提高。

脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的積累,有助于植物應(yīng)對(duì)不利環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果表明：與CK相比,S1和S2處理下茄子幼苗脯氨酸含量均無(wú)顯著變化;S1處理下茄子幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著變化,S2處理使茄子幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低。說(shuō)明半致死 S2處理比S1處理對(duì)茄子的毒害作用大。S2處理的EMS濃度高于S1處理,但處理時(shí)間少于S1處理,猜測(cè)用EMS處理茄子種子時(shí),濃度升高比時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)其傷害更大。這與何慧怡等[24]在EMS誘變甘蔗愈傷組織的試驗(yàn)中得出的結(jié)論相似。

我們只針對(duì)EMS誘變的濃度和時(shí)間組合對(duì)茄子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響做了研究,初步探索出了適合誘變茄子種子的EMS濃度和時(shí)間組合,可為今后建立茄子突變體庫(kù)、豐富茄子育種材料及加快茄子育種進(jìn)程提供參考。但如何對(duì)誘變后的植株進(jìn)行鑒定分析,如何篩選具有目的性狀的變異植株,需要進(jìn)一步探究。