血清外泌體miR-184在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其診斷效能

任 瑩，何 喻，叢玲華

(寧波市鄞州人民醫院 病理科，浙江 寧波 315000)

圖1 血清外泌體miR-184的相對表達量分析

圖2 血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線圖

甲狀腺乳頭狀癌為甲狀腺癌常見的一種組織學分型，臨床治療以手術切除為主，患者一般預后良好，但對于出現被膜侵犯或淋巴結轉移者，預后較差[1]。因此，探尋甲狀腺乳頭狀癌早期診療生物學標記物尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小RNA，長度約為20～23個核苷酸，其參與腫瘤的發生發展[2]。miRNA通過外泌體介導在機體循環系統中穩定運轉，由于不同腫瘤中miRNA表達不同，且具有較高的特異性，推測外泌體miRNA亦可作為腫瘤生物學標記物[3]。因此，本研究對比分析了甲狀腺乳頭狀癌患者、結節性甲狀腺腫患者及體檢健康者血清外泌體中miR-184的表達，探討其診斷甲狀腺乳頭狀癌的臨床價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象 2017年3月—2019年3月我院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者410例，均經手術病理確診，排除合并其他惡性腫瘤者及嚴重心肝腎功能不全者。其中男性187例，女性223例；年齡19～57歲，平均(41.93±3.07)歲。另選取同期就診的結節性甲狀腺腫患者100例、體檢健康者100例作為對照。結節性甲狀腺腫組：男性44例，女性56例；年齡21～62歲，平均(42.77±2.95)歲。體檢健康組：男性39例，女性61例；年齡17～59歲，平均(40.86±2.54)歲。3組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲醫院倫理學委員會審批，入組對象均知情同意。

1.2 血清外泌體miR-184檢測

1.2.1 標本采集 采集3組空腹靜脈血5～8 mL，甲狀腺乳頭狀癌組和結節性甲狀腺腫組患者于術前采集，對照組于體檢當日采集，經離心處理后取上清液存于-80 ℃冰箱中備檢，整個過程避免溶血。

1.2.2 檢測方法 按照ExoQuick-TM試劑盒(生產廠家：美國SBI公司)操作說明提取血清外泌體樣品，經染色后置于日本電子公司生產的tem-100cxⅡ型透射電子顯微鏡下觀察顆粒形態，采用Western Blot檢測外泌體表面蛋白標志物，采用Nanosight檢測外泌體顆粒濃度。應用美國Invitrogen公司生產的Trizol試劑將外泌體樣品進行裂解，將提取的外泌體中總RNA經純化后行逆轉錄，采用Sybr Green法檢測外泌體中miR-184，應用相對定量法計算外泌體中miR-184的相對表達量，根據公式2-ΔCt值= 2-ΔCt值(miR-184)- 2-ΔCt值(miR-39)，miR-39為外參基因。

2 結果

2.1 各組血清外泌體miR-184的相對表達量比較 經電鏡觀察、Nanosight及Western Blot檢測，發現純化的樣品中含有大量外泌體顆粒，與已往文獻報道的外泌體特征相符。本研究顯示，甲狀腺乳頭狀癌組、結節性甲狀腺腫組及體檢健康組患者血清外泌體miR-184的相對表達量分別為(1.24±0.37)、(0.91±0.19)、(0.68±0.22)，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中的外泌體miR-184表達量最高。見圖1。

2.2 ROC曲線分析 以血清外泌體miR-184的相對表達量作檢驗變量，以是否形成甲狀腺乳頭狀癌為狀態變量作ROC曲線。結果顯示，血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感性為91.70%，特異性為82.45%，約登指數為0.748，其曲線下面積為0.829(95%CI：0.704～1.032)，見圖2。

3 討論

miRNA為近年發現的一類內源性小RNA，主要以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在，其在動植物中參與轉錄后調控基因表達[4]。近年來，隨著分子生物學機制的深入研究，發現 miRNA與多種腫瘤的發生進展存在相關性[5]。miR-184為miRNA家族重要的成員之一，既往研究顯示，miR-184在腎癌[6]、人腦膠質瘤[7]等腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。但此類研究大多基于腫瘤組織，收集miRNA檢測樣本時需行有創手術或活檢穿刺，不便于臨床對于甲狀腺乳頭狀癌的篩查。有資料顯示，外周血miRNA可作為腫瘤診斷標記物，且樣本采集方式簡單無創。郭輝等[8]研究報道，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中miR-214的表達高于良性甲狀腺腫瘤患者，提示血清miRNA可作為甲狀腺乳頭狀癌的診斷標記物。

最近有學者提出，miRNA可穩定存在于血清外泌體內，采用血清外泌體miRNA作為腫瘤診斷標記物更加可靠，可避免因血清成分復雜而影響miRNA檢測結果[9]。本研究結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中外泌體miR-184的相對表達量顯著高于結節性甲狀腺腫者及體檢健康者。提示，高表達的miR-184可能與甲狀腺乳頭狀癌的發生存在一定關系。進一步采用ROC曲線分析血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的臨床價值，發現血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感性為91.70%，特異性為82.45%，約登指數為0.748，其曲線下面積為0.829(95%CI：0.704～1.032)。提示，血清外泌體miR-184對甲狀腺乳頭狀癌診斷

效能較高。顏曉慧等[10]對94例肺癌患者進行研究，發現血清外泌體miR-21診斷效能較高，有望成為肺癌早期診斷標志物。張云等[11]對82例原發性肝癌患者進行研究，發現血清外泌體miRNA-122可用于原發性肝癌的早期臨床診斷。以上研究表明，血清外泌體miRNA與多種惡性腫瘤存在相關性，有望成為臨床惡性腫瘤診斷的生物學標志物。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌患者血清外泌體中miR-184呈高表達，其診斷敏感性及特異性較高，或將成為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷生物學標志物。