恒牙與乳牙牙髓干細胞增殖及唾液腺分泌相關分子基因表達比較

龐真貞 李碩 劉欽贊 李曄 王良

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有多向分化的潛能，除了能形成礦化結節能力的細胞外，經過不同細胞因子的誘導，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內皮、肝、神經等細胞系類型[1,2]。牙髓干細胞有以下優點，來源豐富，6～11歲自然脫落的牙齒中、成人需要拔掉的牙齒中均有豐富的牙髓干細胞[3,4]，因此無倫理爭議。本文分析乳牙與恒牙牙髓中唾液腺分泌相關分子水平，分析其是否具有治療唾液腺分泌功能低下的臨床價值。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1～12月的6～11歲脫落乳牙10顆與18～25歲因正畸拔除的完整磨牙10顆，牙齒健康，患者及家屬對治療方法知情同意，對本研究知情同意。排除標準：合并齲齒、根尖病、牙周病。試劑及儀器：20%胎牛血清，DMEM，細胞篩網。

1.2 干細胞純化擴增

1.2.1 牙髓干細胞：取上述刮牙周膜組織牙齒，切開牙冠，暴露牙髓，取出牙髓，浸入3倍雙抗PBS中，后續操作同上，待細胞匯合至80%，傳代。

1.2.2 細胞純化、擴增：分別收集培養的處于對數生長期的牙周膜細胞與牙髓細胞上清液，作為適應性培養基；對培養細胞消化、離心、去上清，加適應性培養基，吹打，過細胞篩，制成單個細胞超過懸液90%，調增細胞密度為每毫升10～15個，接種與96孔培養板，每孔100 μl，培養24 h、48 h，標記單個細胞孔，補至每孔200 μl，第6天，半量換液，隨后每3天換1次。7～14 d，細胞數≥50為出現細胞克隆，待克隆細胞至孔底1/2～2/3后，用0.25%胰酶消化，離心，去上清，移至48孔培養板，繼續培養，至24孔、12孔、6孔，轉入6 cm、10 cm培養皿，獲取去量實驗用細胞。分別取第6代與第8帶牙髓干細胞進行分析。

1.3 第6代與第8代牙髓干細胞生長曲線 將細胞懸液調為密度1×104/ml，接種至96孔板，分為12組，每組6個復孔，分別培養1～10 d，每天取1組，棄培養液，每孔加基礎培養基，5%CO2，37℃培養4 h，酶標儀492 nm處測A值，重復3次，取平均值，比較同一時間兩種細胞OD值。

1.4 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 制備細胞混懸液，密度為1×106/ml，分別裝入EP管中，標記，每組6個管，加入濃度為0.2 mg/ml的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166對應的同型抗體濃度。4℃避光孵育50 min，PBS重懸，離心，棄上清，加PBS重懸，過濾，流式細胞儀測定分析。

1.5 唾液腺分泌相關分子表達 提取牙髓干細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，采用qPCR方法檢測，檢測相關分子基因序列參考文獻[1]。檢測相關分子包括MR1(毒蕈堿型乙酰膽堿受體1)，MR3(毒蕈堿型乙酰膽堿受體3)，APQ5(水通道蛋白5)，β1-AR(β1-腎上腺素受體)，β2-AR(β2-腎上腺素受體)，α-淀粉酶，黏蛋白5B。

2 結果

2.1 第6代與第8代牙髓干細胞增殖比較 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05)，均在第9天達到平臺期。見表1。

類別1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d第6代乳牙0.23±0.080.26±0.080.50±0.100.69±0.121.02±0.231.41±0.321.55±0.411.61±0.441.73±0.481.75±0.51第8代乳牙0.24±0.080.28±0.090.53±0.110.70±0.211.05±0.321.42±0.331.60±0.461.63±0.421.75±0.501.77±0.53第6代恒牙0.23±0.090.30±0.100.55±0.160.73±0.221.04±0.331.42±0.361.62±0.511.62±0.441.78±0.551.83±0.60第8代恒牙0.25±0.080.29±0.090.56±0.170.72±0.211.06±0.351.44±0.451.61±0.501.65±0.461.72±0.561.79±0.55F值0.0810.2150.2190.0530.0180.0070.0260.0150.0150.023P值0.9700.8850.8820.9830.9970.9990.9940.9970.9970.995

2.2 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干細胞標志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

類別CD44CD29CD90CD73CD146CD105第6代乳牙99.52±1.4899.32±1.5799.44±1.6297.43±1.4596.23±1.9497.99±1.48第8代乳牙99.34±1.3699.31±1.6499.80±1.0397.66±1.5296.34±1.6398.04±1.50第6代恒牙99.32±1.5299.35±1.5999.84±1.0698.01±1.6095.98±1.7198.31±1.16第8代恒牙99.63±1.4499.41±1.6299.40±1.1398.15±1.5496.49±1.6898.42±1.25F值0.0640.0060.2100.2760.2160.141P值0.9780.9990.8880.8420.8840.934

2.3 第6代與第8代牙髓干細胞唾液腺分泌相關分子基因表達 MR1在第6代恒牙牙髓干細胞中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙與第8代恒牙表達水平相當。MR3在4組中的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6帶恒牙中的表達水平相似，顯著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表達水平最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表達水平最高，其次為第6代恒牙，第8代乳牙表達水平最低，顯著低于其他3組(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第8代恒牙，顯著高于第6代乳牙與第8代恒牙，差異有統計學意義(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表達水平最低，4組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

類別MR1MR3AQP5β1-ARβ2-ARα-淀粉酶黏蛋白5B第6代乳牙1.05±0.310.13±0.061.05±0.310.93±0.200.95±0.330.98±0.320.97±0.30第8代乳牙0.68±0.210.10±0.031.09±0.320.89±0.220.25±0.070.81±0.350.80±0.26第6代恒牙2.94±0.550.12±0.051.06±0.292.81±0.640.84±0.281.94±0.412.62±0.48第8代恒牙0.62±0.180.09±0.030.31±0.080.78±0.520.64±0.221.62±0.400.40±0.11F值60.5661.01311.91129.6159.46312.28057.371P值0.0000.4080.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

3.1 干細胞分析 干細胞(stem cells)是一類具有自我更新、自我復制能力的多潛能細胞[5]。在一定條件下，它可以分化成多種APSC多能細胞，是一類具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞。多能干細胞(Ps)具有分化出多種細胞組織的潛能，但失去了發育成完整個體的能力，發育潛能受到一定的限制[6]。

3.2 牙髓干細胞 牙髓干細胞無論從數量上，還是分離培養方法上，均具有成為該細胞庫的潛能[7]。牙髓屬于結締組織，有一定的修復再生能力，因成牙本質細胞屬于終末細胞，一旦分化，就不再分裂，因此，一般認為牙本質細胞受損后，牙髓內未分化前提細胞能分化為成牙本質細胞[8,9]。目前認為牙髓干細胞可能來自血管周圍微環境。牙髓干細胞體外培養發現其具有高度增生能力與自我更新能力[10,11]。在本次研究中，第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙增殖趨勢相似，在第9天進入平臺期，并且干細胞標記物表達水平沒有顯著差異，這提示不同代次的乳牙與恒牙牙髓干細胞一般生物學特性詳細。

3.3 牙髓干細胞唾液腺分泌相關分子基因表達 唾液腺分泌受腺上皮細胞表達的MR與AR調控，MR激活可調節AQP5，調節水的快速轉運。MR、AQP5可衡量唾液腺水分泌功能。α淀粉酶、黏蛋白是唾液中重要的蛋白質，其分泌受β-AR調控[12]。對不同代次乳牙與恒牙牙髓干細胞中唾液腺分泌相關分子的基因表達水平進行分析，結果顯示MR1在第6代恒牙牙髓干細胞中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙與第8代恒牙表達水平相當。MR3在4組中的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6帶恒牙中的表達水平相似，顯著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表達水平最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表達水平最高，其次為第6代恒牙，第8代乳牙表達水平最低，顯著低于其他3組(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第8代恒牙，顯著高于第6代乳牙與第8代恒牙，差異有統計學意義(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表達水平最低，4組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。這結果提示第6代乳牙、第8代乳牙以及第6代恒牙、第8代恒牙均有不同水平的唾液腺分泌相關分子基因表達，雖然第6代恒牙在MR1、β1-AR、α-淀粉酶、黏蛋白5B表達水平更高一些，但第6代乳牙相關基因的表達也相對穩定，并且乳牙牙髓干細胞相對于恒牙，更容易獲得。

3.4 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105是牙髓干細胞的常見標志物，可在牙髓干細胞中完全表達，可在一定程度上對口腔疾病進行有效判斷。本研究顯示，恒牙與乳牙牙髓干細胞生長情況與干細胞標記物相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

綜上所述，恒牙與乳牙牙髓干細胞生長情況與干細胞標記物沒有顯著差異。第6代與第8代乳牙及恒

牙表達不同水平的唾液腺分泌相關分子基因，為唾液腺功能低下的治療提供了新的可能，并且乳牙牙髓干細胞更容易獲得，有望成為理想的組織工程種子細胞。