苦參堿注射液對中晚期口腔癌患者炎癥、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的影響

趙偉萍 李合芳 馬妍敏 陶曉蕾

口腔癌是臨床常見的口腔頜面部惡性腫瘤，具有惡性程度高、浸潤性強(qiáng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)，因而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后差[1,2]。目前，手術(shù)和放化療對晚期口腔癌和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者療效欠佳，1/2以上的患者生存期不足1年[3,4]。苦參堿注射液是一種中藥制劑，具有抗炎、抗病毒、提高免疫功能等功效，但其作用機(jī)制尚未闡明。有研究證實(shí)，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)活化后通過誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位促進(jìn)IL-6、TNF-α、VEGF釋放，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[3,4]。本研究采用苦參堿注射液聯(lián)合化療治療中晚期口腔癌，觀察聯(lián)合治療對患者炎癥、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年10月在我院接受治療的中晚期口腔癌患者60例，隨機(jī)分為對照組和治療組，每組30例。對照組：男20例，女10例；年齡39～70歲，平均年齡(50.32±7.12)歲；KPS評分：≥70分21例，<70分9例；發(fā)病部位：齒齦癌14例，舌癌11例，舌背癌5例。治療組：男21例，女9例；年齡41～72歲，平均年齡(51.53±7.45)歲；KPS評分：≥70分22例，<70分8例；發(fā)病部位：齒齦癌13例，舌癌12例，舌背癌5例。2組年齡、性別比、KPS評分、發(fā)病部位等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合口腔癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者表現(xiàn)為典型的吞咽困難、出血、腫塊等癥狀體征，且均經(jīng)病理確診；②根據(jù)UICC分期方法，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期；③KPS評分≥60分；④患者一般狀況良好，能耐受化療；⑤腫瘤未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑥均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②心、肝、肺、腎等重要臟器功能障礙者；③既往接受過放療、化療者；④藥物過敏患者。

1.3 治療方法 2組均給予常規(guī)化療，具體方案如下：紫杉醇150 mg/m2，第1天；順鉑100 mg/m2，第1天。28 d為1個化療周期，共治療3個周期。治療組在常規(guī)化療基礎(chǔ)上加用苦參堿注射液治療，苦參堿注射液20 ml溶于250 ml 0.9%氯化鈉液，靜脈滴注，1次/d，直至化療結(jié)束后3 d，共治療3個周期。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 標(biāo)本采集:采患者空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清。

1.4.2 分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs):取10 ml肝素抗凝的外周血，置于預(yù)先加入5 ml Ficoll的離心管中，密度梯度離心法分離得到PBMCs。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA):采用ELISA測定2組治療前后血清IL-6、TNF-α、Bcl-2、VEGF、MMP-9、TLR2、TLR4、NF-κB水平。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù):1640培養(yǎng)液重懸PBMCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加入FITC抗體，孵育15 min，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 2組血清炎性因子水平比較 治療前2組血清IL-6、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組血清IL-6、TNF-α水平均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組血清IL-6、TNF-α水平低于對照組(P<0.05)。見表1。

組別IL-6(ng/L)TNF-α(g/L)對照組 治療前180.75±20.3214.69±2.11 治療后138.92±16.66?9.24±1.20?治療組 治療前182.24±22.7613.99±2.06 治療后70.22±9.65?#5.13±0.68?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.2 2組血清凋亡相關(guān)因子水平比較 治療前2組血清Bax、Bcl-2水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組血清Bax水平均明顯高于治療前，Bcl-2水平均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組血清Bax水平高于對照組，Bcl-2水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

組別BaxBcl-2對照組 治療前1.34±0.204.11±0.62 治療后2.29±0.34?3.00±0.46?治療組 治療前1.36±0.194.08±0.57 治療后3.51±0.46?#2.12±0.30?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.3 2組血清侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子水平比較 治療前2組血清VEGF、MMP-9水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組血清VEGF、MMP-9水平均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組血清VEGF、MMP-9水平低于對照組(P<0.05)。見表3。

組別VEGFMMP-9對照組 治療前167.49±20.32147.88±16.34 治療后119.76±12.78?106.43±12.64?治療組 治療前170.33±18.52145.79±15.90 治療后60.22±8.65?#62.88±9.45?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.4 2組血清TLRs/NF-κB信號通路相關(guān)因子水平比較 治療前2組血清TLR2、TLR4、NF-κB水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組血清TLR2、TLR4、NF-κB水平均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組血清TLR2、TLR4、NF-κB水平低于對照組(P<0.05)。見表4。

組別TLR2TLR4NF-κB對照組 治療前58.61±6.9067.49±8.3217.88±2.34 治療后40.17±5.14?45.76±5.78?10.43±1.64?治療組 治療前56.79±5.8870.33±10.5216.79±2.60 治療后21.65±2.39?#24.22±2.84?#6.88±1.05?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.5 2組PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)比較 治療前2組PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)低于對照組(P<0.05)。見表5。

組別TLR2TLR4NF-κB對照組 治療前30.29±4.1332.89±4.3628.96±3.53 治療后24.02±3.46?25.16±3.74?22.49±3.05?治療組 治療前29.65±4.5433.21±5.0030.11±4.27 治療后17.68±2.76?#18.44±2.30?#15.62±2.33?#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3 討論

口腔癌是好發(fā)于40歲以上中老年人的口腔惡性腫瘤，病變惡性程度高，進(jìn)展快，易侵犯臨近組織和淋巴結(jié)，患者一經(jīng)確診大多為中晚期，預(yù)后極差[5-7]。口腔癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為該病發(fā)生發(fā)展與吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣、遺傳因素、營養(yǎng)狀況等多種因素有關(guān)。由于長期吸煙、飲酒產(chǎn)生的毒性和刺激性物質(zhì)對牙齦、口腔黏膜的反復(fù)刺激使口腔處于應(yīng)激狀態(tài)，如果不能保持良好的口腔衛(wèi)生習(xí)慣容易導(dǎo)致各種病原菌滋生，此時機(jī)體對致癌物敏感性增加，因而造成口腔癌發(fā)生發(fā)展。對于錯失手術(shù)時機(jī)的中晚期口腔癌患者，化療是其最主要的治療手段，但單一化療抗腫瘤效果不理想，目前尚無有效的聯(lián)合治療方案。因此，尋找安全有效的治療措施對于提高中晚期口腔癌治療效果，改善患者預(yù)后至關(guān)重要。苦參堿是傳統(tǒng)中藥苦參的主要有效成分，具有抗炎、抗病毒的功效。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移和新生血管形成發(fā)揮抗腫瘤作用[8,9]。臨床研究表明，苦參堿注射液治療宮頸癌能夠增強(qiáng)化療藥物敏感性，抑制炎性反應(yīng)，同時改善細(xì)胞免疫功能[7]。本研究前期應(yīng)用苦參堿注射液治療中晚期口腔癌，結(jié)果表明，苦參堿注射液能夠顯著提高近期療效，但其發(fā)揮治療作用的可能機(jī)制尚不明確。

研究顯示，腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞浸潤和炎性因子高表達(dá)，貫穿于腫瘤發(fā)生發(fā)展的始末，參與調(diào)控腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、血管生成等多個方面[10]。IL-6是腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，研究表明IL-6在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織表達(dá)增高，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤轉(zhuǎn)移和血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥等多個方面參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[11,12]。TNF-α是單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，研究表明，乳腺癌、口腔癌患者高表達(dá)TNF-α，通過調(diào)控MMPs表達(dá)降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，且其高表達(dá)通常預(yù)示預(yù)后不良[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮越來越重要的作用，細(xì)胞凋亡與相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生的重要病理機(jī)制[15]。Bax、Bcl-2是機(jī)體重要的凋亡控制因子，存在于線粒體膜上的Bcl-2通過改變線粒體膜電位、調(diào)節(jié)線粒體膜對凋亡蛋白通透性等機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2家族中的促凋亡因子Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞漿，后者通過激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。新生血管形成是腫瘤的重要惡性生物學(xué)行為，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)物質(zhì)。VEGF是調(diào)控血管新生的最重要細(xì)胞因子之一，高表達(dá)于絕大多數(shù)腫瘤組織和血清中，通過與VEGFR1、VEGFR2結(jié)合能夠增加血管通透性并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，從而促進(jìn)新生血管形成[16]。MMP-9是MMPs家族的重要成員，研究表明口腔鱗癌組織高表達(dá)MMP-9，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程，且其表達(dá)與血管生成有關(guān)[17]。本研究觀察了苦參堿注射液對中晚期口腔癌患者血清炎癥、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子水平的影響，結(jié)果表明，治療后2組血清IL-6、TNF-α、Bcl-2、VEGF、MMP-9水平均明顯低于治療前，血清Bax水平均明顯高于治療前(P<0.05)，且治療組血清IL-6、TNF-α、Bcl-2、VEGF、MMP-9水平低于對照組，血清Bax水平高于對照組(P<0.05)，提示慢性炎性微環(huán)境及炎癥、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子分泌異常在口腔癌生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，苦參堿注射液治療中晚期口腔癌能夠顯著降低炎性因子和抗凋亡因子分泌，促進(jìn)促凋亡因子分泌及抑制腫瘤新生血管形成，從而降低腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)化療藥物敏感性。

TLRs是與天然免疫有關(guān)的一類高度保守的病原模式識別受體，是機(jī)體抵御細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物入侵的第一道防線。TLRs在免疫細(xì)胞和炎癥相關(guān)性惡性腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，與其配體結(jié)合后主要通過經(jīng)典的依賴MyD88的信號通路調(diào)控下游靶基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生和釋放。NF-κB是存在于胞質(zhì)中的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠接受TLR2、TLR4等生物學(xué)信號后轉(zhuǎn)移至胞核中參與調(diào)控增殖、凋亡、侵襲等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及進(jìn)展[18,19]。研究發(fā)現(xiàn)TLRs/NF-κB通路的持續(xù)活化促進(jìn)了胃癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，且與臨床分期、浸潤深度及預(yù)后密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后2組血清TLR2、TLR4、NF-κB水平及PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)均明顯低于治療前(P<0.05)，且治療組血清TLR2、TLR4、NF-κB水平及PBMCs中TLR2、TLR4、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)低于對照組(P<0.05)。說明TLRs/NF-κB通路的過度激活與口腔癌病變的發(fā)生密切相關(guān)，苦參堿注射液能夠顯著抑制TLRs/NF-κB通路的過度激活，從而調(diào)控下游靶基因表達(dá)，這可能是苦參堿注射液發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。

綜上所述，口腔癌患者體內(nèi)存在TLRs/NF-κB信號通路的激活及下游炎性因子的異常表達(dá)，隨之加重的炎性反應(yīng)參與口腔癌發(fā)生發(fā)展的全程。苦參堿注射液聯(lián)合化療治療中晚期口腔癌療效確切，能夠顯著抑制炎性反應(yīng)和血管生成，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子表達(dá)，其機(jī)制與抑制TLRs/NF-κB信號通路的激活及下游炎癥、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。