Nupr1在乳腺癌細胞中的作用機制研究

王維娜 趙春蘭 梁月勉 張文清 王曄興

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害女性的健康。乳腺癌的發生發展涉及多個基因異常，目前其發病機制尚不明確，為了提高患者生存率，迫切需要尋找新的治療靶點。Nupr1/p8是1997年Mallo等[1]在研究急性胰腺炎的分子變化中發現的1個小分子核蛋白，研究表明Nupr1/p8參與了胰腺損傷、心肌肥大、性腺發育成熟、肝損傷、紅細胞分化及糖尿病腎病變、軟骨形成、皮膚衰老、體內多部位腫瘤等多種病理生理過程，顯示了抗炎、細胞周期調控、自噬、細胞信號傳導、細胞生長因子及抗凋亡等作用[2-4]。人類P8基因定位于染色體16p11.2，編碼82個氨基酸組成的小分子核蛋白，相對分子量約8X103，故被命名為P8。后來Ree 等[5]在乳腺癌轉移相關分子機制研究中克隆到的轉移候選因子(candidate of metastasis 1,com-1)，經結構分析就是P8。隨后P8、com-1又被統一命名為Nupr1(nuclear protein 1)。隨后研究發現它在多種腫瘤中存在異常表達，主要通過控制細胞凋亡及參與細胞內信號傳導，起到腫瘤生長啟動子的作用，參與腫瘤的發生及進展，然而在某些研究中卻發現了相反的作用[6]。國外一些學者研究了它在乳腺癌發生及進展中的作用，但不同的研究結果不太一致，所有研究均發現乳腺癌組織中Nupr1較正常組織表達增高，然而具體到它的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系，不同的研究得出的結論不盡相同[1-4]。關于Nupr1在體外腫瘤細胞中的作用機制目前國內筆者尚未見到相關研究報道。本研究通過沉默乳腺癌MDA-MB-231細胞的Nupr1基因，抑制Nupr1的表達。采用流式細胞術檢測細胞凋亡，以MTT法檢測細胞增殖情況，克隆形成實驗檢測細胞生長能力，Western blot法檢測實驗組細胞ki67和Survivin的表達，探討Nupr1基因在乳腺癌細胞增殖、凋亡中的作用，進一步闡明Nupr1基因與乳腺癌發生、進展、預后的關系，以期更好地指導臨床個體化治療。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國ATCC公司(ATCC,Manassas,VA)。RPMI 1640細胞培養液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司。ki67和Survivin抗體購自Santa Cruz;Nupr1引物由上海生物工程有限公司合成，qRT-PCR試劑盒購自。Nupr1 siRNA重組慢病毒及siRNA control重組慢病毒委托上海比昂公司協助構建(利用primer5軟件設計人Nupr1的RNA干擾序列(5’-CAT GCC TAT CAC TTC A)。 陰性對照RNAi使用一個與人類基因組無同源性的序列(5’-TTCC GAA CGT GTC ACG T)。將上述序列克隆到pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)(Gene Chem，中國上海)構建慢病毒載體。并測定慢病毒的滴度)。異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/ propidium iodide，annexinⅤ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑購自凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:細胞在含5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中(Thermo)，37℃條件下培養細胞。細胞培養液含10%胎牛血清、200 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中，當細胞處于對數生長期時，以含有EDTA的0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉染:乳腺癌細胞株貼壁生長至40%～50%時，接種至新的培養板中培養，孵育16 h，用適當滴度的病毒上清液(1.5 ml/孔)代替培養基，37℃孵育10 h后，用新鮮培養基代替病毒上清液繼續培養。轉染5 d后，用實時定量RT-PCR法測定短發夾RNA(shRNA)的敲除效率。Nupr1(211 bp)引物序列 ： 5′-GCG GGC ACG AGA GGA AAC-3′;5′-CTC AGT CAG CGG GAA TAA GTC-3′; GAPDH作為內參標，引物(121 bp)序列：5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3′; 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′。取逆轉錄產物2 μl，加入引物各0.5 μl、SYBR GREEN MAsterMix 10 μl置 iQTM SYBR Green Supermix上(Bio-Rad,Her-cules,CA)。PCR循環參數95℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s，共循環40個周期,72℃ 4 min 延伸。樣本均設3個平行對照以保證實驗結果的準確性。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。 與空白對照組相比，Nupr1 RNAi下調99%，差異有顯著性，因此，Nupr1 RNAi可以有效地下調Nupr1的表達水平。將感染Nupr1 siRNA的乳腺癌細胞株作為實驗組，感染Nupr1 siRNA control的細胞株作為陰性組，未做處理的乳腺癌細胞株作為空白對照組。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡:細胞經慢病毒感染5 d后，制成細胞懸液，實驗組和陰性組、對照組各設置3個復孔。離心并棄上清，收集細胞密度為1×105/ml 細胞懸液，PBS沖洗3次，70%預冷乙醇沉淀。離心棄去乙醇， PBS沖洗3次，加入RNA酶和溴化乙錠(PI)工作液(使PI最終濃度為50 μg/ml)，染色后流式細胞儀檢測，采用細胞周期分析軟件檢測實驗組及陰性組細胞凋亡。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力:實驗組和陰性組、空白對照組細胞以每孔5 000個細胞接種培養板，每組共15孔，培養24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入5 mg/ml MTT 40 μl,在37℃ 5% CO2培養箱中培養4 h，棄掉孔內上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩20 min，全自動酶標儀檢測570 nm波長處吸光度(OD)值。

1.2.5 集落形成試驗分析Nupr1沉默對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響:將實驗組和陰性組細胞，加裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿器勻漿，將處于對數生長期的細胞按照700個/孔接種于6 cm細胞培養皿中，設置3個復孔，隔3 d換液觀察細胞狀態，培養7 d，細胞集落用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛(PFA)固定15 min，用Giemsa染色20 min，再用ddH2O沖洗2次，顯微鏡下觀察>50個細胞的克隆計數。克隆形成率=(集落數目/200)×100%。

1.2.6 Western blot 法檢測細胞中Ki67 及Survivin的表達:取對數生長期的細胞，PBS洗滌3次，加入400 μl 含PMSF的裂解液，提取蛋白并進行蛋白定量。取50 ng蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜至硝酸纖維素膜，封閉，加鼠抗人Survivin抗體及Ki67抗體(1∶1 000)，GAPDH(小鼠，1∶1 000，ABCAM，ab8245)4℃過夜孵育，PBS洗滌后加入二抗1 h，DAB顯色。測定條帶的面積和灰度，計算積分灰度值。

2 結果

2.1 敲除Nupr1后對細胞凋亡的影響 由于活細胞對于染料 PI 具有抗性，而壞死細胞則無抗性，通過Annexin-FITC、PI 雙染色法來檢測 Nupr1 敲除后乳腺癌細胞凋亡是有效的。空白對照組、陰性組、Nupr1敲除組凋亡率分別為(3．56± 0．76)%、(4．28±1．43)%、(20．98±5． 87)%。空白對照組與陰性組比較，細胞凋亡差異無統計學意義(t=0.77,P>0.05)，而實驗組與對照組比較細胞凋亡率顯著升高(t=5.09,P<0.05)，說明敲低Nupr1水平后，MDA-MB-231細胞的凋亡明顯增加；這些結果表明下調Nupr1，通過增強腫瘤細胞凋亡，可能對乳腺癌細胞的體外生長有抑制作用。

2.2 敲除Nupr1對乳腺癌細胞增殖的影響 慢病毒感染后，陰性組與空白對照組在24 h、48 h、72 h、96 h細胞增殖能力差異無統計學意義(P均>0.05)；敲除組細胞在24 h、48 h、72 h、96 h的OD值與對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)，實驗組細胞增殖力均低于空白對照組,說明Nupr1低表達可抑制細胞增殖。見表1。

組別24h48h72h96h空白對照組0.38±0.040.52±0.030.87±0.081.07±0.08陰性組 0.37±0.020.51±0.040.85±0.071.05±0.13敲除組 0.21±0.030.30±0.020.37±0.030.41±0.02t值6.0710.4710.2014.04P值<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 敲除Nupr1對乳腺癌細胞的克隆形成的影響 陰性組細胞克隆形成情況與空白對照組比較差異無統計學意義(t=0.158,P>0.05)。敲除組細胞克隆形成率與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(t=9.62,P<0.05)。見表2。

組別克隆形成率空白對照組30.02±2.04陰性組 29.76±1.98敲除組 15.68±1.34t值9.62P值<0.05

2.4 細胞中Ki67及Survivin的表達情況 陰性組與空白對照組Ki67及Survivin表達差異無統計學意義(t=0.81、t=1.59;P>0.05)。敲除組Ki67及Survivin表達均低于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.0005)。見表3，圖1、2。

組別SurvivinKi67空白對照組0.82±0.040.47±0.05陰性組 0.79±0.050.40±0.06敲除組 0.42±0.060.14±0.01t值9.759.64P值<0.05<0.05

圖1 Western blot檢測Survivin蛋白表達

3 討論

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的健康與生命。近年來，乳腺癌患者的生存率得到很大提高，然而復發及轉移仍然是影響患者生存率的主要問題，因此對乳腺癌細胞增殖、凋亡調控機制的研究彰顯重要。P8是一個相對分子量約8×103的小分子核蛋白，由Nupr1基因編碼。它為廣泛分布于體內的應激誘導蛋白，參與了體內多部位多種病理生理過程，顯示了抗炎、細胞周期調控、自噬、細胞信號傳導、細胞生長因子及抗凋亡等作用。Ree等[5]研究發現p8與乳腺癌轉移相關，命名為乳腺癌轉移候選因子(candidate of metastasis 1,com-1)。隨后Jung等[7]用比較基因組雜交技術研究了具中樞神經系統轉移潛能的早期乳腺癌細胞系中基因組不穩定的發生情況，發現染色體16p11.2及17q12循環區改變與腫瘤預后不良有關，二者共同陽性的腫瘤預后更差，推測基因拷貝數的異常改變參與了腫瘤的轉移，他的研究進一步從基因水平證實Nupr1與乳腺癌預后不良的相關性。Jiang等[8]卻發現乳腺癌中預后較差的及淋巴結陽性的腫瘤Nupr1表達降低，他們認為Nupr1在乳腺癌細胞中的作用與在膀胱癌、前列腺癌中的作用類似，可能起著腫瘤抑制基因的作用，其中Nupr1可能受雌激素和泛素通路雙重調節。而Ito等[9]發現Nupr1的表達與乳腺癌細胞凋亡指數、腫瘤大小及UICC分期均呈負相關。在乳腺浸潤性癌中Nupr1的高表達率與腫瘤分期有關，腫瘤的分期越晚，Nupr1高表達率越高，且與淋巴結轉移有關。且預后相對不良的HER-2型和三陰性型，Nupr1的表達顯著高于預后較好的Luminal型，推測在乳腺癌的晚期進展中，Nupr1可能起了重要作用，且它的高表達與乳腺癌的預后不良有關[10]。這種截然不同的作用也許是基于不同種腫瘤的微環境不同。

圖2 Western blot檢測Ki67蛋白表達

關于Nupr1在體外腫瘤細胞中的作用機制，最近研究較多。RNAi是基因功能分析的有用工具，可能是治療包括癌癥在內的各種疾病的一種潛在治療策略。因此，慢病毒與RNAI的結合為腫瘤基因治療提供了一種新的治療思路。評估有效抑制乳腺癌細胞生長的靶點可以促進基因沉默的臨床應用。要想成功抑制細胞Nupr1的表，構建沉默Nupr1表達的載體非常關鍵。我們首先確保Nupr1 RNAi可以有效地下調Nupr1的表達水平，這是實驗成功的首要步驟。Zeng等[11]通過敲低Nupr1 基因研究Nupr1 基因下調對人多發性骨髓瘤 U266 細胞增殖及凋亡的影響，結果發現敲低Nupr1 水平后，U266細胞增殖減弱，凋亡率明顯增加。認為Nupr1基因在多發性骨髓瘤細胞的增殖及凋亡中起重要作用。鄧躍林等[12]用腫瘤抑制劑鹽酸素處理非小細胞肺癌細胞后發現細胞Nupr1 蛋白表達量下降，Nupr1基因沉默后通過上調 TIMP-1 的表達，下調 MMP-2 的表達降低肺癌 A549 細胞的侵襲和遷移能力，進而促進非小細胞肺癌細胞凋亡。在肝癌及膠質母細胞瘤及其他腫瘤中的研究也得到了相似的結果[13,14]。抑制Nupr1的表達可降低肝癌細胞集落形成能力，抑制膠質母細胞瘤的細胞增殖。這些結果均在體外細胞中直接證實了Nupr1對腫瘤細胞的作用，而Nupr1是否和如何影響乳腺癌癌細胞的存活尚不清楚。本研究結果同樣首次證實在乳腺癌細胞中，細胞轉染抑制Nupr1基因表達后，乳腺癌細胞增殖活性降低，凋亡明顯增加，這與其他學者在不同腫瘤細胞的研究結果相似，推測Nupr1可能通過影響細胞增殖和凋亡過程促進腫瘤形成，從而為更好的了解乳腺癌發病機制提供理論依據。

Ki67為一種細胞核抗原，在增殖活性細胞中表達。它的表達水平能夠反映細胞的增殖能力，且與腫瘤的惡性生物學行為相關。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。細胞信號系統是細胞生長、分化、凋亡及物質代謝的調控系統，任何一個環節發生異常均會導致疾病的發生。本研究結果顯示敲除Nupr1基因后乳腺癌細胞Ki67及Survivin表達水平下降，推測Nupr1在乳腺癌細胞中作用機制可能是通過降低Survivin表達，抑制腫瘤細胞增殖活性，發揮抗腫瘤作用。

本研究結果顯示，沉默Nupr1基因后，乳腺癌細胞增殖能力降低，細胞克隆形成數降低，提示Nupr1在乳腺癌細胞增殖中起促進作用。

綜上所述，乳腺癌細胞中抑制Nupr1的表達可以降低細胞增殖能力，檢測組織中Nupr1的表達、探討其與細胞內信號機制的關系可從嶄新的角度明確乳腺癌發生的機制，檢測Nupr1的表達水平可能作為乳腺癌早期發現、判斷預后及采用個體化治療方案的有用指標。