A型肉毒毒素對增生性瘢痕組織aFGF和bFGF因子mRNA表達的作用

武鳳蓮 朱東來 王嘉欣 王連英

傷口愈合的過程本身就是一個動態的、錯綜復雜的，同時受很多因素影響，其過程主要包括三個階段:炎性反應階段、肉芽組織形成階段和基質形成或重構階段[1]。當傷口愈合階段發生任何變化時，就會導致個體產生病理性瘢痕[2]。這些病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[3]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的傳統治療包括按摩壓迫治療、硅膠治療、激光治療、光療和放療[4]。幾種新興的治療方案包括腔內冷凍治療，腔內注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)、干擾素和博萊霉素[5]。盡管治療增生性瘢痕有很多方法，但每種方法都有局限性。已有研究報道了A型肉毒毒素(BTXA)在治療增生性瘢痕中的應用，并取得了良好效果[6,7]。 BTXA減輕早期增生性瘢痕瘙癢癥狀，部分抑制瘢痕萎縮，促進瘢痕軟化，減少攣縮作用，也有研究觀察到抑制成纖維細胞增殖和膠原分泌，但其分子機制尚不清楚[6,8]。為研究BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞的影響，探討BTXA對增生性瘢痕調節的分子機制，采用MTT法、羅丹明123染色、H2DCFDA熒光檢測瘢痕成纖維細胞內的活性氧ROS,qPCR等方法研究不同濃度BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞的影響。我們特別確定了BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞生長因子aFGF和bFGF的影響，這些是影響增生性瘢痕組織中細胞異常增生和分化，膠原等細胞外基質過度分泌沉積的重要影響因素[9]。本研究為肉毒毒素的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 瘢痕組織標本 標本來源于2016至2018年我院整形燒傷外科的門診及住院患者，患者近期激光、放射線及其他藥物治療，病程3個月～4年。瘢痕部位包括面部、上肢、胸背部，取標本前均得到患者的知情同意。

1.2 化學藥品與儀器 BTXA(蘭州生物制品研究所)， DMEM培養基(Gibco公司 USA)，Trizol 總RNA提取試劑盒美國 PROMEGA公司，逆轉錄試劑盒、taq酶購于日本TAKARA；染色羅丹明123、MTT、DMSO購于SIGMA US,H2DCFDA購自 Invitrogen， 新生小牛血清(杭州四季青公司)，熒光顯微鏡，流式細胞儀，PCR 儀器。

1.3 增生性瘢痕成纖維細胞的培養 將取下的手術標本按無菌操作程序反復沖洗3次后，剪去多余皮下組織后，將只保留帶表皮的瘢痕組織剪成所需大小的小組織塊，緩沖液反復沖洗干凈后接種于含有培養液的培養方瓶中，在特定條件的孵箱進行瘢痕成纖維細胞原代的培養，根據原代成纖維細胞的生長情況進行更換培養瓶中的培養液，待原代成纖維細胞爬滿瓶底進行傳代培養，細胞藥物實驗所用細胞為3～6代。

1.4 MTT檢測瘢痕成纖維細胞的活力 取對數生長期的瘢痕成纖維細胞,用胰酶消化后的調制成為1×106/ml成纖維細胞懸浮液，以每孔200 μl的成纖維細胞密度接種于96孔培養板中。置于5% CO2，37℃培養箱培養約24 h至細胞長至單層。待細胞完全貼壁后去除培養液，用PBS洗1～2遍，加入用含血清的培養基稀釋得到各組BTXA濃度的藥液。每個藥物濃度組(0.2、0.4、0.6、1.6 U/ml)及對照組設6個復孔，每孔加 150 μl藥液,將細胞板繼續置于培養箱中孵育24 h,棄上清，用PBS緩沖液溶液洗2遍，后每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl繼續孵育3 h后，棄掉上清液，每孔加200 μl DMSO振蕩混勻，沉淀溶解完全后用自動酶標比色儀在波長 490 nm 處讀取吸光值(A490)時測定其OD值。計算藥物的抑制率 (IR)。IR=(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 羅丹明123染色 用羅丹明123染色技術評估BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞線粒體膜通透性的影響。將成纖維細胞制成1×106懸浮液接種于96孔培養板中，用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細胞進行24 h培養，并與對照組細胞進行比較。培養24 h后，PBS沖洗細胞，每孔加入羅丹明123染液(10 μg/ml)10 μl,置于37.0℃、5%(體積分數)的CO2飽和溫度的孵箱中繼續孵育15 min。然后熒光顯微鏡下觀察細胞，用Image軟件進行評價。

1.6 H2DCFDA檢測瘢痕成纖維細胞內的活性氧(ROS) 利用熒光探針H2DCFDA 檢測對照組及用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細胞內ROS的產生情況。將增生性瘢痕成纖維細胞制成1×106懸浮液接種于96孔培養板中，用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細胞進行24 h培養，并與對照組細胞進行比較。細胞孵育培養24 h后，棄細胞培養板內細胞上清液，細胞板內用 PBS 清洗細胞后棄 PBS。然后每孔內分別加入H2DCFDA工作液(終濃度為 10 μmol/L)置 37℃、5% CO2的細胞培養箱內避光染色 15 min。經胰酶快速消化及 PBS 終止洗滌，1 500 r/min 離心 5 min 后，最后加入 200 μl PBS 重懸，后在激發波長488 nm,發射波長525 nm條件下在流式細胞儀檢測各樣本平均熒光強度，該值代表細胞ROS水平。

1.7 RNA提取與qPCR 總RNA是從增生性瘢痕成纖維細胞中分離出來，將含有不同濃度BXTA及對照組的培養液加入對數生長的密度為1×106個/ml的成纖維細胞混懸液中，將細胞放置于孵育箱中培養24 h，棄上清液收集細胞。按總RNA抽提試劑盒說明書，操作步驟按試劑盒的操作指南進行。采用 Trizol 法提取總 RNA，經NanoDrop ND-2000 紫外分光光度儀檢測完整性后于-80℃保存備用。對所有樣品取1 μg總RNA，利用Promega公司的逆轉錄試劑盒的操作步驟進行合成 cDNA。1 μl cDNA與1 μl 引物混合，于15 μl反應體系進行擴增。將各組樣本擴增后的10 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠掃描成像分析儀處理系統掃描各條帶紫外光吸收量(Vol)。以為β-actin內參，檢測各組bFGF和aFGF基因的Vol與內參β-actin的Vol的比值作為目標基因的相對表達量，并比較對照組與加入不同濃度肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纖維細胞bFGF和aFGF基因的表達的變化。引物序列如下：bFGF(303 bp):上游引物5’-AGCGGCTGTACTGCAAAAAC-3’，下游引物5’-CAGTTCGTTTCAGTGCCACA-3’,aFGF(430 bp):上游引物5’-GGAATTCCATATGGCTAATTACAAGCCCA-3’,下游引物5’-AAGAGATCTTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3’,β-actin(166 bp):上游引物5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’，下游引物5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’。

2 結果

2.1 MTT檢測結果 采用MTT法測定不同濃度BTXA對成纖維細胞的抑制作用。與對照組(1.020±0.031)比較，0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml BTXA(5.62±0.0121,15.01±0.023,32.25±0.124,51.21±0.214,72.47±0.061)處理的細胞中存活的成纖維細胞數量顯著減少，且呈劑量依賴性(P<0.01)。

2.2 羅丹明123染色結果 細胞凋亡的初始事件是線粒體膜電位的降低和細胞色素C的釋放，而線粒體膜電勢的變化通常反映線粒體膜穩定性的狀態，一旦線粒體膜穩定性變差，即線粒體膜通透性增高致使趨向發生凋亡，因此，本實驗采用羅丹明123染色評估跨膜線粒體膜通透性的變化。相近細胞數目情況下，與對照組成纖維細胞比較,0.4 U/ml與0.8 U/ml A型肉毒毒素處理組的細胞綠色熒光降低，線粒體膜電位降低(P<0.01)，線粒體膜通透性發生變化。提示BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞有抑制增殖并誘導細胞凋亡的作用。見圖1。

對照組0.4U/ml0.8U/ml

圖1肉毒毒素對瘢痕成纖維細胞膜電位的影響

2.3 細胞內 ROS 改變 H2DCFDA作為一種活細胞染料，它在進入活細胞膜內能夠被細 胞內酯酶作用并轉化生成為H2DCF，而后者對細胞內各類ROS 敏感且極容易被其氧化并生成 2’，7’-dichloroflurorescein 產物(DFC)。而氧化后產物具有強熒光特性，通常結合熒光顯微鏡或流式細胞術檢測細胞內ROS水平，根據平均熒光強度變化來表示細胞內ROS水平。由此，我們選擇H2DCFDA 并結合流式細胞術檢測,選擇濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml的A型肉毒毒素預處理對增生性瘢痕成纖維細胞內ROS水平的影響。肉毒毒素處理組(0.4 U/ml時174.28%，0.8 U/ml時247.36%)與對照組100%比較，細胞內ROS水平顯著升高(P<0.01)，并且高濃組顯著高于低濃度組(P<0.05)。見表1，圖2。

組別aFGFbFGF對照組 110.2U/mlBXTA組0.890±0.211?0.900±0.012?0.4U/mlBXTA組0.790±0.051?0.750±0.036?0.8U/mlBXTA組0.615±0.027?0.520±0.024?1.6U/mlBXTA組0.402±0.012?#0.491±0.142?#

注：與對照組比較,*P<0.05;與0.2 U/ml BXTA比較,#P<0.01

2.4 qPCR結果 與對照組比較，對用濃度分別為0.2 U/ml、 0.4 U/ml 、0.8 U/ml、1.6 U/ml的A型肉毒毒素的培養液培養48 h的增生性瘢痕成纖維細胞中的bFGF和aFGF蛋白的表達量呈明顯下降趨勢,說明A型肉毒毒素可抑制bFGF和aFGF兩種因子的表達,并且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，bFGF和aFGF兩種因子蛋白表達呈劑量依賴趨勢，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖3。

圖2 肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細胞內活性氧的影響

圖3 不同濃度BTXA(U/ml)對aFGF及bFGF mRNA表達的影響

3 討論

成纖維細胞生長因子(FGF)于20世紀40年代首次被發現，并于1974年人們從牛垂體中分離出來[10,11]。FGF家族的所有成員都有一定的相似之處，但都有其獨特的特征。FGF家族包括這些酸性和堿性亞型，表現出廣泛的生物活性。人aFGF和bFGF蛋白均由154個氨基酸組成，受體相同，序列同源性超過55%[12,13]。酸性FGF(aFGF)作為細胞分裂的促進因子，是細胞增殖和分化的有效促進因子[14]。堿性FGF(bFGF)主要作用于中胚層和神經外胚層來源的細胞，也是一種功能強大的細胞分裂因子。在大多數生物活性分析中，bFGF表現出比aFGF更強的效力[15,16]。在生理條件下，酸性FGF以陰離子形式存在，堿性FGF以陽離子形式存在，兩種生長因子都沒有信號肽結構，分泌方式尚不明確。aFGF和 bFGF作為重要的細胞分裂因子，能夠直接作用血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，從而促進新的毛細血管生成[17]。酸性FGF能夠主動與創面邊緣細胞的細胞膜上的受體特異性結合，誘導細胞分裂、增殖和遷移，促進皮膚和黏膜創面愈合。堿性FGF能夠促進肉芽組織過度生長的同時，還可以誘導細胞外基質的合成，刺激結締組織增生，從而加速創面的愈合[18]。

BTX是一種神經毒性蛋白，由肉毒桿菌及相關物種產生。它存在于各種血清型(A至G)。A型肉毒毒素(BTXA)可用于臨床及各種疾病的治療[19,20]。 近年來，在瘢痕的臨床治療中，BTXA被越來越多的人重視并開始應用，并取得了良好的臨床治療效果[21-23]。雖然BTXA廣泛用于病理性瘢痕的治療，但其分子機制尚不清楚。BTXA最初應用于瘢痕的預防和治療，是因為它可以降低切口張力。我們都知道決定瘢痕最終外觀的重要關鍵因素是在愈合過程中作用于傷口邊緣的張力[24]。傷口邊緣的張力可以直接(機械地)和間接(化學地)導致病理性瘢痕的生成。垂直于傷口邊緣的張力往往會機械地拉伸傷口肌肉，從而扭曲正常的傷口愈合過程，從而導致增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成[25]。當局部注入BTXA時，BTXA通過抑制神經肌肉連接部位乙酰膽堿的釋放而起作用 ，會導致傷口肌肉暫時麻痹而固定，從而降低垂直張力。BTXA可以在傷口愈合過程中幾乎完全消除傷口上的動態張力，從而改善傷口瘢痕愈合[26]。也有研究發現BTXA能有效抑制成纖維細胞的生長[21]。BTXA對增生性瘢痕和瘢痕疙瘩作用機制的另一理論就是其對成纖維細胞周期分布的影響。成纖維細胞過度增殖是導致增生性瘢痕重要的因素之一[27]。BTXA可能通過改變病理性瘢痕上的凋亡、遷移和纖維化通路，直接調節成纖維細胞的活性，從而改善其外觀[27]。

本研究中，我們觀察了不同濃度的BTXA對增生性瘢痕中成纖維細胞的影響。不同的細胞毒性信號，如活性氧，生長剝奪和死亡受體誘導細胞中的凋亡信號。對照組細胞和肉毒毒素處理組細胞的H2DCFDA染色結果清楚地描繪出A型肉毒毒素增加了活性氧(ROS)的產生。羅丹明123染色結果表明，A型肉毒毒素誘導的ROS產生并導致凋亡蛋白的活化，從而增加了增生性瘢痕成纖維細胞線粒體膜通透性。線粒體膜通透性的增加導致細胞色素C等促凋亡蛋白的釋放，從而激活凋亡蛋白進而誘導細胞的凋亡[28]。本研究中我們還研究了不同濃度的A型肉毒毒素作用的增生性瘢痕成纖維細胞中aFGF和bFGF蛋白表達的變化，肉毒毒素處理組細胞與對照組細胞比較，aFGF和bFGF蛋白表達降低。本結果提示：BTXA對增生性瘢痕組織中成纖維細胞的生長有抑制并誘導其凋亡的作用，且具有濃度依賴性，與對照組比較aFGF和bFGF蛋白的表達隨著BTXA濃度的增加而降低。結果提示BTXA對增生性瘢痕組織成纖維細胞增殖方面具有明顯的抑制作用，其作用機制可能是通過降低aFGF和bFGF蛋白的表達，從而導致增生性瘢痕內成纖維細胞增殖的減緩，凋亡的增加，細胞外基質合成分泌降低。其具體的分子機制、aFGF和bFGF與細胞凋亡的具體作用及細胞周期及信號通路的具體調控將是我們進一步深入研究探討的方向。