基于異丁酯化的脂肪酸GC-FID/MS定量分析研究

干渺妍，謝 暉，唐惠儒,

1. 復旦大學生命科學學院，上海 200433；2. 復旦大學人類表型組研究院，上海 201203

脂肪酸是生物體內重要的能量[1-2]和結構物質，可通過代謝轉化為三磷酸腺苷為心肌和肝臟等組織提供能量[3]，也可用于合成磷脂、激素及酮體等具有生理功能的物質。研究顯示，脂肪酸代謝失調會導致炎癥[4]、腫瘤[5-6]及心血管疾病[7]等，因此定量分析此類物質隨生理及病理生理過程的變化具有重要意義[8-12]。基于脂肪酸所含碳數的不同，其可被分為短鏈（C1～C6）、中鏈（C8～C12）和長鏈（C16～C26）脂肪酸。目前，對其進行同步定量是代謝組學分析及生理與病理生理機制研究中亟待解決的問題。

脂肪酸的定量分析主要包括核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance，NMR）[13-14]、氣相色譜 - 氫火焰離子化檢測器/質譜聯用技術（gas chromatography-f l ame ionization detector/mass spectrometry，GC-FID/MS）[15]及液相色譜 - 質譜聯用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）等[16-17]。其中，GC-FID/MS將氣相色譜穩定分離的優勢與FID及質譜的高靈敏度檢測相結合，成為了脂肪酸的定量分析的一種重要方法。該技術具有良好的重現性和線性動態范圍[18]，擁有商業化的標準質譜庫，可以輔助對未知物的定性。氣相色譜分離要求待測物具有良好的揮發性及熱穩定性，而脂肪酸由于含有極性官能團羧基且鏈長不同使得其物理化學性質差異較大，因此常需先對其進行化學衍生化處理。目前，脂肪酸的衍生化方法主要有三甲基硅烷化[19-22]及甲酯化[23-25]。其中，前者常用的試劑是N, O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺和N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺。上述2種試劑極易水解，因此在衍生化前要求樣本行干燥處理，同時衍生化過程須在無水條件下進行；而該種操作使樣品在前處理時較為繁雜、耗時，且易導致分析對象（即代謝物）發生損失。甲酯化法被廣泛用于中長鏈脂肪酸的定量分析，但這種方法衍生化耗時較長，且應用于短鏈脂肪酸產生的甲酯化產物易揮發，因此甲酯化法不適合對短、中、長鏈脂肪酸進行同步定量分析。

針對上述問題，本文利用GC-FID/MS中的FID與質譜同步檢測，并通過對脂肪酸進行異丁酯化建立一種簡便快速、條件溫和且可對水相介質中短、中、長鏈脂肪酸進行同步定量分析的方法；同時，使用27種脂肪酸對該方法進行驗證，并通過將該方法應用于血清、尿液、糞便、肝臟等典型的常見生物樣本以驗證其基質普適性，從而為生理及病理生理過程中脂肪酸的變化規律及其功能研究提供新的方法。限公司，十二烷酸購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，4-甲基己酸購自加拿大TRC公司，乙酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司。上述脂肪酸樣品分別用水配制成已知濃度的標準溶液，并密封貯存待檢。

1 材料與方法

1.1 試劑

本實驗所用試劑均購自商業化產品來源而未經任何純化。異丁醇購自上海化學試劑研究所有限公司，色譜純正己烷購自美國Merck公司，無水硫酸鈉購自上海大合化學品有限公司，（-） -氯甲酸薄荷酯、氫氧化鈉、吡啶、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、癸酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、芥酸、二十二烷酸、二十四烷酸均購自美國Sigma-Aldrich公司，甲酸、丙酸、異丁酸、新戊酸、丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、戊酸、2-乙基丁酸、異己酸、己酸、庚酸、正辛酸、十四烷酸、亞油酸、油酸、亞麻酸均購自阿拉丁試劑（上海）有

1.2 研究方法

1.2.1 脂肪酸的異丁酯化 本研究采用異丁酯化的方法對標準溶液或生物樣本進行衍生化處理，具體操作如下：取100 μL標準溶液于離心管中，加入130 μL氫氧化鈉水溶液（20 mmol/L）、50 μL 吡啶和80 μL 異丁醇后渦旋震蕩 10 s。加入20 μL （-） -氯甲酸薄荷酯渦旋震蕩30 s，放氣后再渦旋震蕩30 s。再次加入20 μL （-） -氯甲酸薄荷酯，重復上述渦旋震蕩步驟。完畢后，向上述衍生化混合物加入150 μL正己烷并渦旋萃取2 min，16 099×g離心5 min。取上清液，經無水硫酸鈉干燥后，將其加入氣相色譜進樣瓶中檢測。

1.2.2 GC-FID/MS檢測及數據分析 本研究使用配有FID的氣相色譜 - 質譜儀（7890B-5977A，美國Agilent Technologies公司）和HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美國Agilent J&W公司）對衍生化后的脂肪酸進行分析。采用分流進樣（分流比為29:1），進樣量為1 μL。進樣口溫度為280 ℃，載氣氦氣（純度＞99.999%）的流速為1.0 mL/ min。色譜柱起始溫度為40 ℃，保持3 min后以 10 ℃ /min升至145 ℃，以30 ℃ /min升至175 ℃，再以10 ℃ /min升至260 ℃，保持1.5 min，最后以30 ℃ /min的速率升至310 ℃，保持3 min。FID溫度為280 ℃，氫氣流速為30 mL/min。質譜溶劑延遲時間4.2 min，將質量選擇檢測器（mass selective detector，MSD）傳輸管及電子離子化（electron ionization，EI）源溫度設為230 ℃，燈絲電壓固定為 70 eV。質譜采集采用選擇離子掃描模式（selective ion monitoring，SIM），檢測碎片離子作為各目標物定性定量離子。使用MassHunter軟件（定性分析B.06.00版以及定量分析B.06.00版，美國Agilent Technologies公司）分析上述檢測獲得的GC-FID/MS數據。所有代謝物根據其保留時間及質譜碎片質荷比分布信息進行定性分析，標準溶液中對提取的定量離子色譜峰進行積分得到定量數據。

1.2.3 方法學驗證 本研究使用27種脂肪酸樣品建立標準曲線并得到檢測限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）；使用高濃度、中濃度、低濃度的樣品混合溶液測量方法的日間及日內的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。通過與文獻報道結果比較評估方法的靈敏度及穩定性，具體操作如下。

本研究所用的脂肪酸樣品的母液由雙蒸水及10%異丁醇水溶液配制而成，其中碳數小于6的脂肪酸用雙蒸水作為溶劑配制。研究采用逐級稀釋法建立標準曲線，將脂肪酸樣品的母液稀釋1、2、4、10、20、40、100倍后獲得的7個濃度梯度標準溶液分別進行衍生化，并依次進行GCFID/MS分析檢測。將進樣的柱上摩爾數作為橫坐標，峰面積作為縱坐標得到標準曲線及其對應的線性范圍。LOD及LOQ分別為信噪比等于3和10時的代謝物柱上量。此外，選用稀釋1、10及100倍的3個濃度的標準溶液經衍生化后進行日內及日間RSD評估，即將衍生化后的標準溶液置于室溫，1 d內每間隔8 h檢測1次，計算3次峰面積間的RSD值作為日內RSD評價；標準溶液在3 d內檢測3次，計算3次峰面積間的RSD值作為日間RSD評價，且標準溶液在測定間隙需置于4 ℃保存。

1.2.4 普適性分析 將所建方法應用于血清、尿液、糞便、肝臟等生物樣本的脂肪酸進行定量分析，以驗證該方法在不同生物基質中的普適性。本研究所用血清樣本源于健康青少年（13歲～18歲），尿液樣本來源于健康成年人（25歲），血清和尿液樣本均為已通過倫理審批的代謝組研究生物樣本，采集后儲存在-80 ℃冰箱；實驗前，將樣本梯度解凍后可直接進行衍生化處理，通過前述建立的方法對樣本中的脂肪酸進行分析。本研究使用的糞便來源于健康嬰幼兒（0歲～3歲），糞便樣本為已通過倫理審批的代謝組研究生物樣本，肝臟樣本來源于雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠；實驗時將樣本梯度解凍后稱取糞便0.042 6 g、肝臟組織0.054 6 g，分別加入500 μL 10%異丁醇水溶液，采用組織破碎儀（德國QIAGEN公司）進行勻漿（每次20 Hz勻漿90 s，間隔60 s，循環3次）；隨后，在冰浴中以45 Hz持續30 s、80 Hz持續30 s交替超聲10 min，進一步提取生物樣本中的代謝物；提取后的糞便及肝臟組織經離心后，取100 μL勻漿液進行衍生化處理并使用GC-FID/MS對衍生化后的脂肪酸進行分析。

2 結果

2.1 脂肪酸的異丁酯化

脂肪酸異丁酯化的反應原理已在文獻[26]中報道。本研究通過優化衍生化過程中的試劑用量、時間、處理方法等參數，建立了27種脂肪酸的異丁酯化方法。該反應可直接在水相中進行，常溫下渦旋震蕩1 min即可完成衍生化，且衍生化產物較穩定。

2.2 GC-FID/MS檢測

本研究在文獻[27]報道的升溫程序基礎上，結合不同鏈長脂肪酸異丁酯的性質，優化確定了分析的升溫梯度及分流比等色譜分離參數。結果（圖1）顯示，使用（-） -氯甲酸薄荷酯與異丁醇對27種脂肪酸進行衍生化后，脂肪酸在HP-5MS色譜柱上可較好保留且峰型良好，其中甲酸及乙酸也可與溶劑峰分離，從而實現對甲酸和乙酸更準確的定性定量分析。

圖1 27種脂肪酸異丁酯的GC-MS色譜圖Fig 1 GC-MS chromatogram of 27 kinds of fatty acids isobutyl esters

本研究對脂肪酸的色譜保留時間、質譜定性及定量離子進行分析，結果（表1）顯示27種脂肪酸經衍生化后均具有特征質譜碎片離子及不同的保留時間，可用于脂肪酸的定性與定量分析。各脂肪酸的定量離子為具有特征性的且抗基質噪音干擾能力較強的質譜碎片離子，同時各脂肪酸存在3～4個輔助定性離子。因此，在復雜樣本中或基質干擾嚴重時，使用SIM進行分析可增加定量準確性。

表1 27種脂肪酸配制濃度及其異丁酯色譜質譜信息Tab 1 Concentrations of 27 kinds of fatty acids and GC-MS data for the isobutyl esters

2.3 方法學驗證

本研究使用27種脂肪酸進行定量分析方法的驗證，主要包括線性范圍、線性回歸方程、LOD、LOQ、日內及日間RSD。結果（表2）表明，在使用質譜的SIM時，27種脂肪酸在2～3個數量級濃度范圍內的線性方程R2值均可達0.99，其LOD在柱上0.03～2.96 pmol之間，LOQ在0.09～9.86 pmol之間，與文獻中所述方法[28]相似。同時，使用FID及質譜檢測器SIM采集模式進行樣品檢測時發現，大部分短鏈及中鏈脂肪酸的質譜響應優于FID，長鏈脂肪酸的FID檢測靈敏度則高于質譜。此外，27種脂肪酸在低濃度、中濃度和高濃度情況下的日內及日間RSD均小于10%，說明方法具有良好的穩定性及精密度。

表2 脂肪酸異丁酯定量方法的線性、靈敏度、精密度及穩定性分析Tab 2 Analysis of linearity, sensitivity, precision and stability for isobutylation-based fatty acid quantification method

2.4 生物樣本的普適性分析

本研究以健康青少年的血清、成年人的尿液、嬰幼兒的糞便及大鼠肝臟為典型生物樣本，各選擇1例就上述脂肪酸定量方法對不同基質的普適性進行驗證。結果（圖2、表3）表明，該方法在血清樣本中至少可檢測到10種脂肪酸，主要為短鏈及長鏈脂肪酸，而中鏈脂肪酸較少；在尿液樣本中可檢出7種脂肪酸；在糞便樣本中至少可檢測到14種脂肪酸，其中乙酸含量明顯高于其他脂肪酸，這與文獻[29]報道結果相一致。此外，糞便樣本中可檢測到丙酸、2- 甲基丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸，這些脂肪酸在其他3種生物樣本中未檢測到。大鼠肝臟樣本可檢測到9種脂肪酸。但由于選取樣本量有限，上述結果并未涉及對生物學問題（如代謝物的生物學意義等）的回答，僅涉及所建方法對多種生物樣本的適用性；后續在方法的具體應用中，研究者需考慮生物樣本個數的重復及統計學要求。

圖2 4種典型生物樣本中脂肪酸的GC-MS譜圖Fig 2 GC-MS chromatograms of fatty acids in four typical biological samples

表3 4種典型生物樣本中脂肪酸的含量Tab 3 Concentration of fatty acids in four typical biological samples

3 討論

脂肪酸是細胞的重要能量來源、結構組成成分及信號物質，對其組成及變化規律進行定量分析是全局性認識此類代謝物在生理及病理過程中的功能的關鍵突破口。就傳統的脂肪酸硅烷化及甲酯化分析方法而言，其衍生化步驟繁瑣、耗時，且硅烷化分析方法必須在無水條件下進行，干燥過程易造成代謝物的損失。為此，本研究使用（-） -氯甲酸薄荷酯和異丁醇作為衍生化試劑，建立了一種基于異丁酯化的27種脂肪酸的GC-FID/MS定量分析方法，與文獻[20]中報道的方法相比具有以下優勢：首先，此方法可以在水相中進行，樣品前處理快速便捷且無需對水進行去除或絕對隔離；其次，此方法克服了脂肪酸甲酯化或乙酯化產物的易揮發性，避免了檢測前處理造成的脂肪酸酯的揮發損失；再次，此方法提高了甲酸及乙酸異丁酯的色譜保留，避免了其與溶劑峰重疊的問題，可實現短、中、長鏈脂肪酸的同步定量分析。

本研究通過優化相關參數，對27種脂肪酸進行了定性定量分析，包括甲酸和乙酸等在內的脂肪酸經衍生化后，實現了與溶劑峰有效分離進而被檢測。使用的FID及質譜檢測器SIM采集方式的檢測靈敏度均可達到十億分之一級。實驗結果表明，對于短鏈及中鏈脂肪酸SIM響應更高，對于長鏈脂肪酸FID的響應優于SIM；但在復雜樣本中或基質干擾嚴重時，仍然應使用SIM進行分析以增加定量準確性。方法學驗證結果顯示，該反應在一定濃度動態范圍內呈線性（R2＞0.99），且方法靈敏度高（LOQ＜10 pmol）。代謝物定量分析的日內和日間RSD均小于10%，這表明當樣本在常溫下放置24 h或在4 ℃下放置3 d時，此方法不影響甲酸和乙酸等易揮發性脂肪酸定量結果的穩定性。因此，該方法可用于自動化程度較高的大樣本脂肪酸定量分析研究。

本研究進一步以典型常見生物樣本（血清、尿液、糞便、肝臟）為對象，對所建立方法的生物樣本基質普適性進行驗證。通過與標準溶液比對，在健康青少年血清、健康成年人尿液、嬰幼兒糞便和大鼠肝臟4種常見哺乳動物的生物樣本中，分別可檢測到10、7、14和9種脂肪酸。其中，在糞便樣本中可檢測到多種短鏈脂肪酸且以乙酸含量最高，該結果與文獻[29]報道相符合；糞便中檢測到的丁酸源于腸道菌群對膳食纖維的發酵，其可作為結腸上皮細胞的重要營養物質，具有調節腸道內pH值的功能，此外其還可作為G蛋白偶聯受體的天然配體。本研究盡管只聚焦27種代表性脂肪酸，但所建立的方法也可用于其他脂肪酸的定量分析，特別是血清與肝臟組織中的其他長鏈脂肪酸。此結果與本課題組使用甲酯化方法進行脂肪酸定量分析的前期研究[25]相比，對長鏈飽和及不飽和脂肪酸的檢測處于同等數量級水平；雖然亞麻酸、二十烷酸等脂肪酸未被檢出，但本方法擴大了短、中鏈脂肪酸的檢測覆蓋度，同時也為進一步擴大長鏈不飽和脂肪酸的檢測覆蓋度提供了可能。

綜上，本研究所建立的脂肪酸定量分析方法具有簡便、快速、條件溫和的特點，可直接在水相中進行衍生化反應以減少代謝物損失，簡化了前處理步驟，滿足了代謝組分析對通量的需求；同時，該方法增加了脂肪酸檢測的覆蓋范圍，可實現短、中、長鏈脂肪酸的同步定量分析。該方法為研究脂肪酸在生理病理狀態下的功能提供了重要的方法學基礎。