一個(gè)伴不完全外顯機(jī)制的Alagille綜合征家系的遺傳學(xué)診斷

胡亞倩，鄭必霞，劉志峰，李玫，金玉，張志華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 消化科，江蘇 南京 210000)

Alagille綜合征(ALGS)是一種常染色體顯性遺傳病，主要發(fā)生于兒童和青少年，病因?yàn)镴AG1或Notch2 基因突變影響Notch信號(hào)通路，從而引起肝內(nèi)小葉間膽管減少[1]。臨床上多因嬰兒期膽汁淤積癥就診，常伴有心臟疾病、骨骼異常、眼部異常和特殊面容等臨床表現(xiàn)。作者回顧一個(gè)家系中兩例ALGS患兒的臨床表現(xiàn)及基因檢測結(jié)果，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)ALGS的臨床特征及遺傳特點(diǎn)，為臨床更好地選擇分子診斷方法并早期識(shí)別、診治ALGS提供思路。

1 病例介紹

1.1 病例一般情況

患兒之兄，6歲，5年前因“發(fā)現(xiàn)肝功能異常伴皮膚瘙癢1月余”至外院就診。大便黃色。查體：眼眶凹陷、前額突出、鼻梁低平、尖下頜，皮膚、鞏膜無明顯黃染(圖1左)；心前區(qū)可及3/6級(jí)收縮期雜音，無傳導(dǎo)；肝臟肋下2.5 cm、劍突下2.0 cm，質(zhì)軟，邊緣光整，無壓痛；脾臟肋下未觸及。間斷口服“保肝、利膽、退黃”藥物治療。目前身高113.0 cm，體重17 kg，頭圍48.5 cm。

患兒，2歲7個(gè)月，因“反復(fù)皮膚瘙癢1年余”入院。大便黃色。查體：頭圍45.8 cm，身高85 cm，體重10 kg，眼距稍寬，下頜尖小，皮膚及鞏膜未見黃染，(圖1右)；心前區(qū)全收縮期3/6級(jí)雜音，無傳導(dǎo)；肝臟肋下2.0 cm、劍突下3 cm，質(zhì)軟，表面光滑；脾臟肋下未觸及。

圖1 患兒之兄(左)及患兒(右)

父母否認(rèn)類似病史，否認(rèn)家族遺傳疾病史。

1.2 臨床檢查

1.2.1 檢查方法

患兒兄既往在外院行JAG1基因一代測序檢測。

采集患兒及其兄、父、母靜脈血3 ml(EDTA抗凝)送至北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行全外顯子組測序，外周血標(biāo)本DNA抽提前，患兒監(jiān)護(hù)人填寫知情同意書，本研究獲南京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。使用血液基因組柱式中量提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用IDT公司xGen?Exome Research Panel v1.0捕獲探針與gDNA文庫序列進(jìn)行液體雜交，將目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行富集，構(gòu)建全外顯子文庫，通過Illumina公司 NovaSeq 6000系列測序儀進(jìn)行高通量測序(PE150)，目標(biāo)序列測序覆蓋度不低于99%。測序過程由智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心完成。

對檢測出的致病可能性較高的基因變異，采用熒光定量PCR(qPCR)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR的引物序列設(shè)計(jì)見表1。

表1 qPCR擴(kuò)增的引物序列

對檢測出的大片段拷貝數(shù)變異，進(jìn)一步采用CNV-seq分析。經(jīng)DNA提取、打斷、文庫構(gòu)建步驟，并經(jīng)Illumina Hiseq系列測序儀測序完成，由Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數(shù)據(jù)，經(jīng)檢測、過濾后由全譜?遺傳病精準(zhǔn)診斷云平臺(tái)系統(tǒng)分析篩選，結(jié)合Decipher、ClinVar、OMIM、DGV、ClinGen、ISCA等數(shù)據(jù)庫比對，并結(jié)合劑量敏感性及臨床特征吻合度等要素綜合分析，對CNV的致病性進(jìn)行分級(jí)。

1.2.2 臨床實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

1.2.2.1 患兒之兄 2014年5月15日：血生化：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1 353.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶953.0 U·L-1，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶537.0 U·L-1，肌酸酶同功酶53.2 U·L-1，堿性磷酸酶 736.6 U·L-1，總膽紅素36.0 μmol·L-1。經(jīng)保肝、利膽退黃治療后2014年5月21日復(fù)查：血生化：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 435.0 U·L-1, 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 234.0 U·L-1,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 295.0 U·L-1,肌酸酶同功酶41.0 U·L-1, 堿性磷酸酶544.0 U·L-1，總膽紅素35.71 μmol·L-1，直接膽紅素29.19 μmol·L-1，總膽固醇8.18 mmol·L-1，膽汁酸329.0 μmol·L-1；巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)DNA陰性；EB病毒抗體IgM陰性；TORCH：風(fēng)疹病毒抗體IgG陽性，余陰性；凝血功能正常；傳染病4項(xiàng)陰性、銅藍(lán)蛋白正常；X線胸片：椎骨未及明顯骨質(zhì)異常；心臟彩超：左右肺動(dòng)脈狹窄、卵圓孔未閉；肝膽胰脾B超未見明顯異常。2017年10月17日門診隨訪：血生化：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶267.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶164.0 U·L-1，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 456.0 U·L-1，總膽紅素26.87 μmol·L-1，直接膽紅素18.19 μmol·L-1，總膽固醇8.91 mmol·L-1。

1.2.2.2 患兒 2019年9月17日：血生化：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶115.0 U·L-1，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶102.0 U·L-1，堿性磷酸酶576 U·L-1，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶316 U·L-1，總膽紅素19.0 μmol·L-1，直接膽紅素12.7 μmol·L-1，總膽固醇7.31 mmol·L-1，總膽汁酸 41.6 μmol·L-1；傳染病4項(xiàng)、凝血功能、體液免疫、細(xì)胞免疫基本正常；EB-DNA、CMV-DNA陰性；EBV抗體、CMV抗體IgM陰性，銅藍(lán)蛋白正常；心臟彩超：(1) 先天性心臟病：房間隔缺損；(2) 主動(dòng)脈瓣輕度狹窄；(3)永存左上腔靜脈；肝膽胰脾B超：肝臟形態(tài)欠規(guī)則，右葉斜徑82 mm、右肋下21 mm；脾臟肋下可及，肋間厚22 mm、肋下19 mm，脾內(nèi)光點(diǎn)均勻分布；心電圖：竇性心律，P-R間期延長，右心負(fù)荷重？Q-T間期延長；X線胸片：心影飽滿，兩肺未及明顯異常，椎骨未及明顯異常。

1.2.3 基因檢測結(jié)果

1.2.3.1 患兒之兄 JAG1基因檢測(外院、Sanger測序)陰性。

1.2.3.2 患兒 采用芯片捕獲高通量測序的方法對先證者全外顯子組進(jìn)行測序，結(jié)果提示：患兒chr20:10018949-10654178區(qū)段疑似存在約635 K大小的雜合缺失，缺失片段中包含完整的JAG1基因，進(jìn)一步采用qPCR的方法驗(yàn)證其JAG1基因外顯子雜合缺失。

1.2.3.3 家系中其他人 將正常對照樣本與先證者及其兄、父、母樣本進(jìn)行同組qPCR檢測，以ALB基因?yàn)閮?nèi)參基因，對目標(biāo)基因JAG1的1，21和26號(hào)外顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：先證者、先證者之兄及先證者之父JAG1基因1，21和26號(hào)外顯子的拷貝數(shù)與正常對照的比值約為0.5，先證者之母JAG1基因1，21和26號(hào)外顯子的拷貝數(shù)與正常對照的比值約為1.0(圖2)，提示先證者及其兄、父JAG1基因1-26外顯子存在雜合缺失，先證者之母JAG1基因1-26外顯子拷貝數(shù)正常。qPCR檢測結(jié)果與全外顯子組測序結(jié)果一致，提示患兒及其兄都存在JAG1基因外顯子雜合缺失，且兩兄弟基因雜合缺失來源于其父親。

圖2 JAG1基因外顯子1-26雜合缺失突變qPCR驗(yàn)證結(jié)果 ALB-Q：內(nèi)參基因；JAG1-1Q：JAG1基因外顯子1；JAG1-21Q：JAG1基因外顯子21；JAG1-26Q：JAG1基因外顯子26

進(jìn)一步采用CNV-seq檢測對患兒及其父親攜帶的累及JAG1基因的雜合缺失進(jìn)行精確定位，發(fā)現(xiàn)患兒及其父親chr20:9965785-11725865位置存在約1.76 Mb的可能致病性CNV，其中包含JAG1基因與Alagille綜合征1型相關(guān)，按照ACMG變異評級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其生物及臨床意義為致病性變異等級(jí)。

2 討 論

ALGS(OMIM:118450)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，又稱先天性肝內(nèi)膽管發(fā)育不良綜合征、動(dòng)脈-肝發(fā)育不良，可累及肝臟、心臟、眼、骨骼、面部等多個(gè)系統(tǒng)，外顯率94%左右，臨床表現(xiàn)從沒有癥狀到危及生命的情況均可發(fā)生[2]。

1997年Oda等[3]首次報(bào)道了JAG1基因突變引起ALGS。JAG1基因定位于染色體20p12，編碼細(xì)胞膜表面蛋白Jagged1蛋白作為配體參與Notch信號(hào)通路[4-5]。2006年McDaniell等[6]報(bào)道了Notch2基因突變也可導(dǎo)致ALGS。Notch2定位于染色體1p11-p13，編碼Notch2跨膜蛋白作為Notch信號(hào)通路的重要受體。NOTCH信號(hào)對膽管的起源至關(guān)重要，在ALGS的病理生理中起著重要作用[7-8]。研究表明94%～96%的ALGS由JAG1基因突變導(dǎo)致，Notch2基因突變占1%～2%，研究并未發(fā)現(xiàn)特定的突變和表達(dá)的表型之間有相關(guān)性[2]。

ALGS常包括心臟、肝臟、骨骼、眼部異常及特殊面容五大臨床特征；也有學(xué)者把腎臟異常及血管畸形納入主要臨床特征。其他特點(diǎn)如身材矮小、發(fā)育落后、反復(fù)感染等亦可見。經(jīng)典的ALGS診斷標(biāo)準(zhǔn)為肝組織活檢有肝內(nèi)小葉間膽管數(shù)量減少或缺如，具有至少5個(gè)主要臨床表現(xiàn)中的3個(gè)，并排除其他可能原因。修訂的ALGS診斷標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為符合4個(gè)或以上主要臨床表現(xiàn)也可診斷，如果已知有JAG1基因突變或陽性家族史時(shí)，1個(gè)以上主要臨床表現(xiàn)通常即可確診[9-10]。因此基因檢測技術(shù)在該疾病診斷中的價(jià)值進(jìn)一步凸顯。本資料家系中患兒及其哥哥因皮膚瘙癢就診，查體有肝臟增大、心臟雜音、特殊面容，輔助檢查血生化顯示肝功能異常、直接膽紅素增高、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶增高、膽汁酸增高等膽汁淤積表現(xiàn)，心臟彩超可見肺動(dòng)脈狹窄、主動(dòng)脈瓣狹窄、房間隔缺損、室間隔缺損等異常。兩兄弟同時(shí)存在肝臟膽汁淤積、心臟改變及特殊面容3項(xiàng)主要臨床表現(xiàn)，但基因檢測明確JAG1基因突變幫助盡早明確了ALGS的診斷。

治療方面，ALGS目前無明確的病因治療手段，主要為保肝降酶、利膽退黃、補(bǔ)充脂溶性維生素、維持營養(yǎng)等，定期監(jiān)測臟器功能。一項(xiàng)對92例ALGS患者的研究[11]表明，隨著年齡的增長，膽管狹窄和纖維化的發(fā)生率顯著增加，最終導(dǎo)致肝硬化或肝衰竭而需要肝移植的患者大約為15%。Hadchouel[12]研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后總的20年平均生存率為70%，Lee等[13]報(bào)道9例該病患兒肝移植后5及20年的生存率分別為88.9%和77.8%。嚴(yán)重膽汁淤積伴皮膚瘙癢的患兒經(jīng)藥物治療無效后可考慮外科手術(shù)干預(yù)，阻斷腸肝循環(huán)，但ALGS患者的膽管發(fā)育不全可導(dǎo)致到達(dá)腸道的膽汁減少，因此ALGS外科手術(shù)治療效果通常比其他引起膽汁淤積的疾病治療效果差；進(jìn)行性膽汁淤積伴頑固性皮膚瘙癢的患兒可考慮肝移植[14-15]。Cardona等[16]報(bào)道，83.3%的ALGS患兒在活體肝移植后瘙癢消失，肝功能檢查結(jié)果正常，提示嚴(yán)重肝型ALGS患兒肝移植后生活質(zhì)量可有明顯改善。本資料家系中患兒及其哥哥在給予阿拓莫蘭、復(fù)方甘草酸苷保肝、熊去氧膽酸利膽退黃、補(bǔ)充脂溶性維生素等治療后肝酶明顯下降，但皮膚瘙癢改善不明顯。長期隨訪如皮膚瘙癢加劇必要時(shí)可行手術(shù)治療改善患兒生存質(zhì)量。

患兒之兄5年前于外院就診，一代測序檢測JAG1基因陰性，但此次qPCR對其JAG1基因外顯子驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)患兒之兄存在JAG1基因的雜合缺失，提示一代測序的檢測方法對基因組拷貝數(shù)變異的檢測有一定的技術(shù)局限性。全外顯子檢測聯(lián)合Sanger測序?qū)Υ_定點(diǎn)突變的位點(diǎn)更有價(jià)值；全外顯子檢測聯(lián)合qPCR可用來檢測出較小的變異并進(jìn)行驗(yàn)證，但對大片段拷貝數(shù)變異的檢測不夠精確，CNV-seq檢測可更精確地檢測大片段拷貝數(shù)變異。因此，根據(jù)疾病的遺傳特點(diǎn)及基因突變的情況選擇合理的基因檢測手段，既能幫助臨床盡早明確病因和診斷、指導(dǎo)合理治療并判斷預(yù)后，也可為病人家庭減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

qPCR驗(yàn)證提示患兒及其兄JAG1基因雜合缺失來源于其父親，但患兒父親臨床上無典型臨床表現(xiàn)，符合JAG1基因外顯率94%左右、可不完全外顯的遺傳特點(diǎn)[17]。該病不完全外顯的特點(diǎn)為疾病的診治帶來了困難。與該疾病相關(guān)的肝臟、心臟、腎臟、眼部病變可單獨(dú)或合并存在于其他綜合征或疾病中[18]，而某些滿足ALGS臨床特征的患者經(jīng)基因檢測卻排除該疾病診斷，如Dyack等[19]報(bào)道的一個(gè)家系中5人患有Alagille-like綜合征卻為常染色體隱性遺傳。Kamath等[20]首次報(bào)道了兩例同卵雙生子ALGS表型不一致的案例，提示非遺傳因素在該疾病表型中有著重要作用。本資料家系中患兒父親與患兒存在相同的拷貝數(shù)變異，但無典型的臨床表現(xiàn)，也可能與非遺傳因素影響疾病表型有關(guān)，因此臨床對疑似ALGS的患者應(yīng)適當(dāng)放寬基因檢測指征，以期盡早明確診斷。

CNV-seq檢測發(fā)現(xiàn)，患兒及其父親chr20:9965785-11725865位置存在約1.76 Mb的致病性CNV。該突變的發(fā)現(xiàn)豐富了JAG1基因變異譜。姜濤等[21]也報(bào)道了chr20p12.2缺失致ALGS患兒1例。WES等基因檢測技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用使得更多基因突變類型得以檢出，對疾病的認(rèn)識(shí)得以進(jìn)一步深入，反復(fù)膽汁淤積是兒科一個(gè)很棘手的問題，因此對反復(fù)膽汁淤積的患兒應(yīng)盡早行基因檢測明確診斷并早期提供遺傳咨詢與指導(dǎo)。