長鏈非編碼RNA TDRG1表達對非小細胞肺癌預后判斷的價值

汪勇，孫寶林，朱駿，徐驍晗

(1.南京市溧水區人民醫院 胸外科，江蘇 南京 211200； 2.南京醫科大學第一附屬醫院心臟大血管外科，江蘇 南京 210029)

研究表明，人類編碼蛋白質的基因僅占總基因組的2%，而非編碼RNA占人類基因組的絕大多數。其中有長鏈非編碼RNA(lncRNAs)，長度超過200個核苷酸，無蛋白質編碼能力[1]。越來越多的證據表明lncRNAs在腫瘤發生中具有致癌作用。例如，LncRNA煙酰胺核苷酸反義轉氫酶RNA1 (lncRNA nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1, lncRNA NNT-AS1)已經顯示在某些類型的癌癥如肝細胞癌中上調[2]。lncRNA睪丸發育相關基因1(lncRNA testis developmental related gene 1，lncRNA TDRG1)通過結合和靶向血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)蛋白增強子宮內膜癌的致瘤性[3]。lncRNA TDRG1可能是上皮性卵巢癌[4]和胃癌[5]中新的重要診斷和治療靶點。然而非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中lncRNA TDRG1的臨床意義尚未闡明。本研究通過檢測人NSCLC組織及其癌旁組織中lncRNA TDRG1的表達水平，探討lncRNA TDRG1與患者臨床特征及預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集南京醫科大學第一附屬醫院2010年至2013年接受手術治療患者的60對NSCLC組織及其相鄰的癌旁組織標本，立即置于液氮中保存直至使用。患者的臨床和病理資料如表1所示。患者均未接受術前化療或放療。本研究經患者所在醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書，所有標本都按照道德和法律標準進行處理和匿名。

表1 lncRNA TDRG1表達與NSCLC患者臨床特征的關系 例

1.2 材料與試劑

TRIzol試劑盒和反轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；染料法熒光定量SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自中國TaKaRa 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取 按照說明書的實驗步驟，使用TRIzol試劑盒提取組織樣品的總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄反應條件：37 ℃ 30 min，然后85 ℃持續5 s，保持在4 ℃。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒實時PCR檢測系統進行qPCR以定量lncRNA TDRG1。按如下條件進行PCR擴增：95 ℃ 30 s，然后95 ℃變性5 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s共40個循環。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內部對照。lncRNA TDRG1引物：上游5′-GAAGAGGAGGGAGGCAGTCT-3′，下游5′-GGGAACCTAGACCTGGGAAG-3′；GAPDH引物：上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。所有實驗重復3次。

1.4 統計學處理

統計分析使用STATA 12.0和SPSS 19.0。采用配對t檢驗比較癌組織與癌旁組織的lncRNA TDRG1表達水平，卡方檢驗評估lncRNA TDRG1表達與臨床病理特征之間的相關性，單因素和多因素Cox風險模型分析臨床病理特征對預后的影響，Kaplan-Meier生存分析計算總生存期。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 lncRNA TDRG1表達在NSCLC腫瘤組織中上調

與鄰近癌旁組織相比，NSCLC組織中lncRNA TDRG1表達顯著升高(t=6.047，P=0.026，圖1A)，提示lncRNA TDRG1與NSCLC的發展有關。

2.2 lncRNA TDRG1表達與患者臨床病理特征之間的關系

lncRNA TDRG1表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系如表1所示。lncRNA TDRG1的表達在性別(男與女)、年齡(<60歲與≥60歲)、組織類型(腺癌與鱗癌)、腫瘤大小(直徑≥3 cm與<3 cm)間差異無統計學意義，但與淋巴結轉移顯著正相關。無淋巴結轉移的腫瘤(N0)與較低的lncRNA TDRG1表達相關，而有淋巴結轉移(≥N1)的腫瘤與較高的lncRNA TDRG1表達相關(χ2=6.747，P=0.009，圖1B)。另外lncRNA TDRG1表達與腫瘤病理分期顯著相關(χ2=21.472，P<0.001，圖1C)。

圖1 lncRNA TDRG1在肺癌與癌旁組織中的表達 A. lncRNA TDRG1在肺癌組織與癌旁組織中的相對表達量，a 兩者比較P<0.05；B. lncRNA TDRG1在N0與N1中的相對表達量，a 兩者比較P<0.05；C. lncRNA TDRG1在Ⅰ期與Ⅱ～Ⅲ期中的相對表達量，a 兩者比較P<0.05

2.3 lncRNA TDRG1表達與NSCLC患者生存期的關系

Kaplan-Meier分析顯示，高lncRNA TDRG1表達組患者的5年總生存期顯著短于低lncRNA TDRG1表達組(P<0.001)，見圖2。

圖2 lncRNA TDRG1表達水平與NSCLC患者生存率的相關性

單因素分析(表2)顯示，性別、年齡、腫瘤大小及組織類型無統計學意義，但TNM分期、淋巴結轉移及lncRNA TDRG1表達具有統計學意義。單因素分析賦值見表3。此外，多變量Cox模型(表4)顯示，TNM分期、淋巴結轉移及lncRNA TDRG1表達分別可作為5年總生存期的獨立預后不良因素。多因素變量分析賦值見表3。

表2 NSCLC患者預后的Cox比例風險回歸(單因素)分析

表3 NSCLC患者預后的Cox比例風險回歸單因素/多因素分析賦值

表4 NSCLC患者預后的Cox比例風險回歸(多因素)分析

3 討 論

NSCLC占所有肺癌病例的80%～85%，并且是全球癌癥相關死亡的主要原因。盡管在了解NSCLC的分子機制和臨床治療方面取得了進展，但其預后仍然很差，NSCLC患者的5年總生存率為15%。NSCLC患者治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤的高轉移潛能以及缺乏有效的早期診斷方法。因此確定用于NSCLC早期診斷和治療的新型生物標志物非常重要。

lncRNAs通常以疾病、組織或發育階段特異性方式表達，使得這些分子成為有吸引力的治療靶點，并且指向發育和疾病特別是人類癌癥中lncRNA的特定功能。許多研究表明lncRNA可能是腫瘤的潛在診斷標志物。AGAP2 antisense RNA 1(AGAP2-AS1)可能是NSCLC診斷和預后判斷的潛在生物標志物[6]。但肺癌中lncRNA TDRG1的差異表達及其預后價值尚未完全闡明。本研究qRT-PCR結果顯示，與鄰近的癌旁組織相比，NSCLC組織中lncRNA TDRG1的表達顯著升高。進一步結合臨床特征進行亞組分析發現，lncRNA TDRG1的高表達與TNM分期及淋巴結轉移密切相關。該結果表明，lncRNA TDRG1可能參與NSCLC的發生發展尤其是腫瘤的轉移過程。lncRNAs具有多種生物功能，包括在細胞增殖、分化和凋亡中的作用。越來越多的證據表明lncRNAs在各種癌癥中發揮重要作用。例如，據報道lncRNA BRAF-activated noncoding RNA (lncRNA BANCR)在子宮內膜癌中表達上調，并促進癌細胞增殖和腫瘤發生[7]。另一項研究發現lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄因子1 (lncRNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, lncRNA-MALAT1)通過與核心蛋白復合物PRC2結合，抑制PCDH10表達，從而促進胃癌細胞的侵襲[8]。因此，以后我們將進一步開展體外、體內實驗，深入研究lncRNA TDRG1影響NSCLC轉移過程的具體分子機制。

此外，lncRNAs已被證實可作為多種疾病的預后因子。例如，lncRNA FOXD2 adjacent opposite strand RNA 1(FOXD2-AS1)的上調預示食管鱗狀細胞癌的預后不良[9]。lncRNA重編程調節物(lncRNA regulator of reprogramming, lncRNA ROR)是與NSCLC進展相關的新型預后因子[10]。為探索lncRNA TDRG1對NSCLC預后的影響，本研究采用log-rank檢驗進行的Kaplan-Meier分析表明，lncRNA TDRG1高表達的患者總體生存時間較低表達患者明顯縮短。單因素和多因素分析進一步確定高表達的lncRNA TDRG1可作為患者總體生存的獨立預后因子。

本研究尚有一些不足：(1) 臨床樣本量較少，僅為60例；(2) 針對臨床特征的亞組分析不夠全面、細致，目前肺腺癌的發病率明顯升高，肺腺癌又可細分為原位腺癌、微浸潤腺癌、浸潤性腺癌；(3) 僅分析了lncRNA TDRG1與5年生存期的關系，而并未全面分析關于疾病復發、無進展生存期等其他預后評價指標。肺癌的發生發展是一個非常復雜的過程，由多個基因多個通路等多種因素綜合導致而成。因此，以后仍需擴大樣本量進行更全面更細致的亞組分析，為lncRNA TDRG1作為不同類型肺癌患者的潛在分子標靶提供更有力的證據。

總之，我們首次初步證實lncRNA TDRG1表達的上調可能與侵襲性疾病進展及NSCLC的不良預后相關，提示LncRNA TDRG1可能參與NSCLC的癌變過程并成為NSCLC的潛在預后指標。有必要進一步研究lncRNA TDRG1促進NSCLC發生和發展的分子機制。